2.4.4.1. Các yếu tố không phải là độc tố
* Kháng nguyên O
Chất lượng thành phần hóa học, cấu trúc kháng nguyên O đều ảnh hưởng tới độc lực của vi khuẩn Salmonella. Cụ thể là: S. typhimurium nếu thay đổi thành phần kháng nguyên từ công thức 1, 4, 12 sang 1, 9, 12 thì vi khuẩn từ dạng c độc lực chuyển sang dạng không c độc lực. Kháng nguyên O là yếu tố độc lực giúp vi khuẩn chống lại khả năng phòng vệ của vật chủ, giúp vi khuẩn phát triển trong tế bào tổ chức, chống lại sự thực bào của đại thực bào. Kháng nguyên O khích thích các cơ quan đáp ứng miễn dịch hình thành kháng thể đặc hiệu ngưng kết với kháng nguyên tương ứng. Cơ chế phòng vệ này giúp cơ thể vật chủ chống lại quá trình tái xâm nhập của vi khuẩn. Đến nay, người ta đã xác định được trên 3.000 serotyp kháng nguyên O của Salmonella, thành phần kháng nguyên của vi khuẩn S. choleraesuis gồm: O6, O7; S. typhimurium gồm: O1, O4, O5, O12; S. enteritidis gồm: O1, O9, O12.
* Kháng nguyên H
Kháng nguyên H không c ý nghĩa trong việc tạo ra miễn dịch phòng bệnh, cũng không quyết định yếu tố độc lực, tuy vậy nó có vai trò bảo vệ cho vi khuẩn không bị tiêu diệt bởi quá trình thực bào, giúp vi khuẩn sống và nhân lên trong các tế bào đại thực bào, cũng như trong tế bào gan và thận.
* Kháng nguyên K
Bản chất hóa học của kháng nguyên K là polysaccharid nhưng thực chất chúng chỉ là thành phần của kháng nguyên O. Kháng nguyên K tạo hàng rào bảo vệ giúp vi khuẩn chống lại tác động ngoại cảnh và hiện tượng thực bào (Nguyễn Như Thanh và cs., 2001).
* Yếu tố bám dính
Kishima et al., (2008) khả năng bám dính của vi khuẩn Salmonella lên tế bào nhung mao ruột là bước khởi đầu quan trọng trong quá trình gây bệnh. Hiện tượng bám dính của vi khuẩn lên bề mặt tế bào vừa mang tính chất lý hóa, vừa mang tính chất sinh học.
* Yếu tố xâm nhập
Cortez et al., (2006) khả năng xâm nhập vào tế bào có nhân hoặc lớp niêm mạc của đường ruột là đặc tính của một số chủng Salmonella c độc lực. Các biến chủng Salmonella không có khả năng xâm nhập vào tế bào thường là các chủng không c độc lực.
Sau khi tiếp cận tế bào vật chủ, vi khuẩn Salmonella tác động làm tăng hàm lượng Ca++ nội bào, hoạt h a Actin Depolimeriring Enzyme, làm thay đổi cấu trúc, hình dạng các sợi actin, biến đổi màng tế bào, dẫn đến hình thành giả túc bao vây tế bào vi khuẩn dưới dạng các không bào chứa vi khuẩn. Sau đ vi khuẩn Salmonella xâm nhập được vào trong tế bào, tồn tại, tiếp tục nhân lên với số lượng lớn, phá vỡ tế bào vật chủ, sản sinh độc tố đường ruột (enterotoxin) và gây tiêu chảy cho vật chủ (Phạm Sỹ Lăng và cs., 2011).
* Khả năng tổng hợp sắt
Van T. et al., (2012) khả năng tổng hợp sắt là một yếu tố giúp vi khuẩn
Salmonella tăng nhanh về số lượng, làm suy yếu khả năng chống đỡ của vật chủ
do bị thiếu sắt.
* Khả năng kháng kháng sinh
Khi vi khuẩn có sẵn những yếu tố gây bệnh, khả năng kháng kháng sinh là một trong các yếu tố quan trọng giúp cho vi khuẩn kháng lại các yếu tố bất lợi của môi trường xung quanh. Hầu hết các chủng Salmonella có khả năng kháng lại một hoặc nhiều loại kháng sinh.
2.4.4.2. Các yếu tố là độc tố
Nếu như các yếu tố gây bệnh không phải là độc tố là những tác nhân gián tiếp, quan trọng trong quá trình sinh bệnh của vi khuẩn Salmonella, thì các yếu tố gây bệnh là độc tố lại là tác nhân trực tiếp quyết định quá trình sinh bệnh. Các yếu tố gây bệnh là độc tố của Salmonella bao gồm: nội độc tố (endotoxin), ngoại độc tố đường ruột (enterotoxin) và độc tố tế bào (cytotoxin).
* Độc tố đƣờng ruột (Enterotoxin)
Độc tố đường ruột của vi khuẩn Salmonella có hai thành phần chính: Độc tố thẩm xuất nhanh RPF (Rapid Permeability Factor) và độc tố thẩm xuất chậm DPF (Delayed Permeability Factor) (Nguyễn Phùng Tiến và cs., 2000).
Độc tố thẩm xuất nhanh có cấu trúc thành phần giống với độc tố chịu nhiệt của vi khuẩn E. coli (Heat-stabile toxin: ST). Yếu tố thẩm xuất nhanh giúp
Salmonella xâm nhập vào tế bào biểu mô của ruột, và thực hiện khả năng thẩm
xuất sau 1- 2 giờ, kéo dài 48 giờ và làm trương tế bào CHO (Chinese Hamster Ovary cell). ST có khả năng chịu được nhiệt độ 100oC trong 4 giờ, bền vững ở nhiệt độ thấp, có thể bảo quản ở -20oC. Cấu trúc phân tử gồm nhiều polysaccharide và một số chuỗi polypeptide. Độc tố thẩm xuất nhanh (RPE) kích thích lên hệ thống men guanylate cyclase trong tế bào biểu mô ruột, chuyển GTP thành GDP. Trong tế bào, GDP tăng cao làm cho nồng độ ion Ca++ cũng tăng cao, dẫn đến ngăn cản hấp thu chất điện giải và nước ở trong xoang ruột. Do vậy, lượng nước trong ruột tăng cao, kích thích niêm mạc ruột, tăng co b p, làm gia súc, gia cầm ỉa chảy.
Theo Phạm Sỹ Lăng và cs. (2011) 72,7% các chủng Salmonella phân lập được từ lợn sau cai sữa bị ốm, chết nghi ph thương hàn sản sinh độc tố chịu nhiệt. + Yếu tố thẩm xuất chậm của Salmonella có cấu trúc, thành phần giống độc tố không chịu nhiệt của vi khuẩn E. coli (Heat Labile Toxin: LT), và thực hiện chức năng thẩm xuất chậm từ 18- 24 giờ, có thể kéo dài 36- 48 giờ. Độc tố thẩm xuất chậm (DPF) bị phá hủy ở 70oC trong vòng 30 phút và ở 56oC trong vòng 4 giờ. Cấu trúc phân tử gồm 3 chuỗi polypeptid và một số hợp chất khác. Phân tử lượng 40.000- 50.000 dalton.
Độc tố thẩm xuất chậm của Salmonella làm thay đổi quá trình trao đổi nước và chất điện giải, dẫn đến tăng cường bài xuất nước và chất điện giải từ mô bào vào lòng ruột, cản trở sự hấp thu, gây thoái hóa lớp tế bào villi của thành ruột, gây tiêu chảy.
Phạm Song và Nguyễn Hữu Quỳnh (2008) kết luận: 81,81% số chủng S.
typhimurium phân lập từ lợn mắc bệnh tiêu chảy sản sinh độc tố không chịu nhiệt
(LT) có khả năng gây tích nước trong ruột non của lợn thí nghiệm.
* Nội độc tố (endotoxin) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nội độc tố nằm ở lớp màng ngoài của tế bào vi khuẩn và được cấu tạo bởi thành phần cơ bản là lipopolysaccharid (LPS). LPS có cấu tạo phân tử lớn, gồm 3
vùng riêng biệt với các đặc tính và chức năng riêng biệt: Vùng ưa nước, vùng lõi và vùng lipit A.
Vùng ưa nước bao gồm một chuỗi polysaccharid chứa các đơn vị cấu trúc kháng nguyên O. Vùng lõi có bản chất là acid heterooligosaccharid, ở trung tâm, nối kháng nguyên O với vùng lipit A. Vùng lipit A đảm nhận chức năng nội độc tố của vi khuẩn. Cấu trúc nội độc tố gần giống với cấu trúc của kháng nguyên O. Cấu trúc nội độc tố biến đổi sẽ dẫn đến sự thay đổi độc lực của Salmonella. Các đột biến gen ở vùng lõi, vùng ưa nước làm cho Salmonella không còn độc lực (Tô Liên Thu, 2004).
Lipit A có ái lực với màng tế bào, với lipit khác và với protein. Điều đ chứng tỏ lipit A chính là trung tâm hoạt động của nội độc tố. Vùng đa đường Polysaccharid, chỉ giữ vai trò là vật mang các lipit không hòa tan.
Nội độc tố là LPS được tiết ra từ vách tế bào vi khuẩn khi bị dung giải. Trước khi thể hiện độc tính, LPS cần phải liên kết với các yếu tố liên kết tế bào hoặc các receptor bề mặt các tế bào như: Tế bào lâm ba cầu B, lâm ba cầu T, tế bào đại thực bào, tiểu cầu, tế bào gan lách.
Rất nhiều các cơ quan trong cơ thể vật chủ chịu sự tác động của nội độc tố LPS: gan, thận, cơ, hệ tim mạch, hệ tiêu hóa và hệ thống miễn dịch với các biểu hiện bệnh lý như: tắc mạch máu, giảm trương lực cơ, thiếu oxy mô bào, toan huyết, rối loạn tiêu hóa, mất tính thèm ăn.
* Độc tố tế bào (cytotoxin)
Đặc tính chung của cytotoxin là có khả năng ức chế tổng hợp protein của tế bào c nhân và làm trương tế bào CHO (Chinese Hamster Ovary cell). Đa phần độc tố của chúng bị phá hủy bởi nhiệt độ. Có ít nhất là 3 dạng cytotoxin:
+ Dạng 1: Không bền vững với nhiệt và mẫn cảm với trypsin. Độc tố này có trọng lượng phân tử khoảng 56 - 78 kDa, n tác động theo cơ chế là ức chế tổng hợp protein của tế bào Hela và làm teo tế bào.
+ Dạng 2: Có nguồn gốc từ protein màng ngoài tế bào vi khuẩn, có cấu trúc và chức năng gần giống với các dạng độc tố tế bào do Shigella và các chủng
E. coli (ETEC) sản sinh ra. Dạng độc tố này cũng c ở hầu hết các serovar
Salmonella gây bệnh.
+ Dạng 3: Dạng này có liên quan với hemolysin. Dạng độc tố này tác động lên tế bào theo cơ chế dung giải các không bào nội bào.Trong phòng thí nghiệm, độc tố này gây chết tế bào Vero, tế bào Hela và tế bào CHO.
Trên đây là 3 loại độc tố gây bệnh chính của vi khuẩn Salmonella, chúng là các tác nhân trực tiếp, quyết định khả năng gây bệnh của vi khuẩn. Một số serotyp như: S. choleraesuis, S. typhimurium, S. enteritidis, S. dublin, S.
gallinarum, S. pullorum c mang các plasmid c kích thước lớn (khoảng từ 50 -
100 kb). Chính những plasmid này có mang các yếu tố di truyền quyết định khả năng sản sinh các yếu tố độc lực gây bệnh cho người và gia súc với tỷ lệ ốm và chết cao (Van et al., 2012).
PHẦN 3. ĐỐI TƢỢNG - NỘI DUNG – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. ĐỐI TƢỢNG 3.1.1. Đối tƣợng
- Đánh giá điều kiện vệ sinh thú y đối với các quầy bán thịt; - Kiểm tra mức độ ô nhiễm một số vi khuẩn trong thịt lợn.
3.1.2. Phạm vi nghiên cứu
Xác định chủng loại vi khuẩn gây ô nhiễm: Trong điều kiện cho phép, phạm vi đề tài chỉ đề cập đến TSVKHK, E. coli và Salmonella.
3.1.3. Địa điểm nghiên cứu
- Địa điểm lấy mẫu: Các quầy kinh doanh thịt tại 05 chợ xây dựng theo mô hình của dự án và 03 chợ không xây dựng theo mô hình của Dự án LIFSAP trên địa bàn huyện Khoái Châu.
- Địa điểm phân tích mẫu: Trung tâm Kiểm tra Vệ sinh Thú y TW I, Cục Thú y.
3.1.4. Thời gian thực hiện đề tài
Từ tháng 06 năm 2015 đến tháng 10 năm 2016.
3.2. NỘI DUNG
- Khảo sát thực trạng điều kiện vệ sinh tại một số quầy kinh doanh thịt tại
các chợ xây dựng theo mô hình của Dự án LIFSAP trên địa bàn huyện Khoái Châu, tỉnh Hưng Yên.
- Xác định TSVKHK, vi khuẩn E. Coli, vi khuẩn Salmonella có trong thịt lợn và các phương tiện vận chuyển, bày bán tại một số chợ trên địa bàn huyện Khoái Châu. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.3. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1. Mẫu nghiên cứu
Chúng tôi tiến hành lấy 533 mẫu của 05 chợ được xây theo mô hình của dự án và 03 chợ không được xây theo mô hình của Dự án LIFSAP trên địa bàn huyện Khoái Châu. Số lượng mẫu cụ thể được trình bày trong Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Số lượng mẫu lấy tại các quầy kinh doanh STT Tên chợ Số quầy bán thịt Số lƣợng mẫu Mẫu lau thân thịt lợn Mẫu nƣớc Mẫu lau dụng cụ kinh doanh Mẫu lau phƣơng tiện vận chuyển Mẫu thịt lợn mảnh Tổng số 1 Bái 28 28 9 9 9 9 64 2 Bô Thời 25 25 9 9 9 9 61 3 Đông Tảo 42 42 9 9 9 9 78 4 Đại Quan 33 33 9 9 9 9 69 5 Phủ 44 44 9 9 9 9 80 6 An Vĩ 28 28 9 9 9 9 64 7 Đại Tập 24 24 9 9 9 9 60 8 Mốc Đá 21 21 9 9 9 9 57
Kỹ thuật lấy mẫu theo tiêu chuẩn: TCVN 6663-1:2001; TCVN 5993:1995; QCVN 01-04:2009; TCVN 4833-1:2002.
Thời điểm lấy mẫu: Vào buổi sáng (6 – 10 giờ) và có biên bản ghi đầy đủ các thông tin trong biên bản lấy mẫu.
3.3.2. Thiết bị, dụng cụ
- Túi đựng bằng chất dẻo vô trùng (túi nilon).
- Etanol 70%/bông thấm nước có tẩm Etanol 70% đựng trong chai. - Gạc, bông khô.
- Dao, kéo vô trùng. - Găng tay vô trùng.
- Thùng xốp bảo quản mẫu với túi đá lạnh.
- Tủ ấm, tủ sấy, tủ lạnh, nồi hấp cách thủy, cân, buồng cấy an toàn sinh học, máy dập mẫu stomatcher, kính hiển vi có vật kính dầu, ống phancon, bộ thuốc nhuộm gram...
- Đèn cồn, nước sinh lý, que cấy nhựa vô trùng dùng một lần, hộp lồng thủy tinh, khay men, cốc đong, ống nghiệm, dao mổ, kéo cong...
3.3.3. Môi trƣờng chính dùng để phân tích một số chỉ tiêu VSV trong thịt.
Bảng 3.2. Môi trường chính dùng để phân tích các chỉ tiêu VSV
STT Chỉ tiêu phân tích Môi trƣờng chính
1 TSVKHK Plate count agar (PCA)
2 E. coli Tryptone Bile X-glucuronide (TBX)
3 Salmonella
Tetrathionat/novobioxin Muller kauffman (MKTTn), Rappaport Vassiliadis (RVS), thạch Deoxycholat lyzin xyloza (XLD), Hektoen enteric agar (HE), thạch máu, KHT O, H đa giá
3.3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
- Lập phiếu kiểm tra, thu thập số liệu về thực trạng điều kiện vệ sinh thú y, tình hình quản lý của các cơ quan hữu quan đối với các quầy kinh doanh thịt lợn tươi sống tại 05 chợ xây dựng theo mô hình của dự án và 03 chợ không xây dựng theo mô hình của Dự án LIFSAP trên địa bàn huyện Khoái Châu, tỉnh Hưng Yên. - Tiến hành lấy 533 mẫu (trong đ 72 mẫu nước, 245 mẫu lau thân thịt lợn, 72 mẫu lau dụng cụ kinh doanh, 72 mẫu lau phương tiện vận chuyển và 72 mẫu thịt lợn mảnh) để phân tích kiểm tra.
3.3.4.1. Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu
a. Kỹ thuật lấy mẫu bằng phương pháp cắt lau (quệt) bề mặt thân thịt
- Chỉ tiêu kiểm tra: kiểm tra các chỉ tiêu VSV như: TSVKHK, E. coli Salmonella.
- Môi trường bảo quản, vật liệu và dụng cụ lấy mẫu
Dung dịch pha loãng nước muối pepton vô trùng (0,1% pepton + 0,85% NaCl), được phân phối vào ống phancon với lượng 15 ml; miếng gạc/mút vô trùng (cần 4 miếng/1 thân thịt); khuôn lấy mẫu vô trùng kích thước 10cm x 10cm, có diện tích trống bên trong 100cm2; etanol 70%/bông thấm nước có tẩm etanol 70% đựng trong chai; găng tay vô trùng; kẹp vô trùng; kéo vô trùng; thùng xốp bảo quản mẫu với túi đá lạnh.
- Cách tiến hành
Lấy mẫu bằng cách dùng miếng gạc hoặc mút vô trùng (kích thước 10cm x 10cm) lau thân thịt, sử dụng 10ml dung dịch pha loãng nước muối pepton
(0,1% pepton + 0,85% NaCl) vô trùng làm ẩm miếng gạc, miếng mút hay tăm bông trước khi lấy mẫu. Vùng lấy mẫu phải bao trùm tối thiểu 100 cm2 trên một vị trí lấy mẫu. Miếng hấp phụ phải được làm ẩm ít nhất 5 giây trong dung dịch pha loãng. Sử dụng khuôn lấy mẫu định vị kích thước 10cm x 10cm và dùng kẹp vô trùng đặt miếng hấp phụ vào khuôn, sau đ di kẹp vô trùng trên bề mặt miếng hấp phụ theo chiều dọc, ngang, chéo trong khuôn mỗi chiều 10 lần, không ít hơn 20 giây. Cho miếng hấp phụ vào túi bằng chất dẻo vô trùng, thêm tiếp lượng dung dịch pha loãng nước muối pepton vô trùng sao cho đủ 25ml. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
b. Kỹ thuật lấy mẫu nước
- Chỉ tiêu kiểm tra: Kiểm tra TSVKHK, E. coli. - Môi trường bảo quản, vật liệu và dụng cụ lấy mẫu
Chai vô trùng có thể tích đủ để chứa mẫu xét nghiệm; thùng chứa mẫu (có đá để bảo quản).
- Cách tiến hành
Lấy mẫu tại các vòi nước, thời gian xả nước từ 2 – 3 phút trước khi lấy mẫu, lấy với lượng 300 ml. Sau đ đậy kín bình chứa mẫu và bảo quản ở nhiệt độ 50C - 200C và vận chuyển đến phòng thí nghiệm trong vòng 8 giờ.
c. Kỹ thuật lấy mẫu bằng phương pháp lau bề mặt dụng cụ kinh doanh
- Chỉ tiêu kiểm tra: kiểm tra các chỉ tiêu VSV như: TSVKHK, E. coli, Salmonella.
- Môi trường bảo quản, vật liệu và dụng cụ lấy mẫu
Dung dịch pha loãng nước muối pepton vô trùng (0,1% pepton + 0,85% NaCl), được phân phối vào ống phancon với lượng 15 ml; miếng gạc/mút vô trùng; khuôn lấy mẫu vô trùng kích thước 10cm x 10cm, có diện tích trống bên