Phần 3 Đối tƣợn g nội dung – nguyên liệu và phƣơng pháp nghiên cứu
3.3.2.Thiết bị, dụng cụ
3.3. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
3.3.2.Thiết bị, dụng cụ
- Túi đựng bằng chất dẻo vô trùng (túi nilon).
- Etanol 70%/bơng thấm nước có tẩm Etanol 70% đựng trong chai. - Gạc, bông khô.
- Dao, kéo vô trùng. - Găng tay vô trùng.
- Thùng xốp bảo quản mẫu với túi đá lạnh.
- Tủ ấm, tủ sấy, tủ lạnh, nồi hấp cách thủy, cân, buồng cấy an toàn sinh học, máy dập mẫu stomatcher, kính hiển vi có vật kính dầu, ống phancon, bộ thuốc nhuộm gram...
- Đèn cồn, nước sinh lý, que cấy nhựa vô trùng dùng một lần, hộp lồng thủy tinh, khay men, cốc đong, ống nghiệm, dao mổ, kéo cong...
3.3.3. Mơi trƣờng chính dùng để phân tích một số chỉ tiêu VSV trong thịt.
Bảng 3.2. Mơi trường chính dùng để phân tích các chỉ tiêu VSV
STT Chỉ tiêu phân tích Mơi trƣờng chính
1 TSVKHK Plate count agar (PCA)
2 E. coli Tryptone Bile X-glucuronide (TBX)
3 Salmonella
Tetrathionat/novobioxin Muller kauffman (MKTTn), Rappaport Vassiliadis (RVS), thạch Deoxycholat lyzin xyloza (XLD), Hektoen enteric agar (HE), thạch máu, KHT O, H đa giá
3.3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
- Lập phiếu kiểm tra, thu thập số liệu về thực trạng điều kiện vệ sinh thú y, tình hình quản lý của các cơ quan hữu quan đối với các quầy kinh doanh thịt lợn tươi sống tại 05 chợ xây dựng theo mơ hình của dự án và 03 chợ khơng xây dựng theo mơ hình của Dự án LIFSAP trên địa bàn huyện Khoái Châu, tỉnh Hưng Yên. - Tiến hành lấy 533 mẫu (trong đ 72 mẫu nước, 245 mẫu lau thân thịt lợn, 72 mẫu lau dụng cụ kinh doanh, 72 mẫu lau phương tiện vận chuyển và 72 mẫu thịt lợn mảnh) để phân tích kiểm tra.
3.3.4.1. Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu
a. Kỹ thuật lấy mẫu bằng phương pháp cắt lau (quệt) bề mặt thân thịt
- Chỉ tiêu kiểm tra: kiểm tra các chỉ tiêu VSV như: TSVKHK, E. coli Salmonella.
- Môi trường bảo quản, vật liệu và dụng cụ lấy mẫu
Dung dịch pha lỗng nước muối pepton vơ trùng (0,1% pepton + 0,85% NaCl), được phân phối vào ống phancon với lượng 15 ml; miếng gạc/mút vô trùng (cần 4 miếng/1 thân thịt); khuôn lấy mẫu vơ trùng kích thước 10cm x 10cm, có diện tích trống bên trong 100cm2; etanol 70%/bơng thấm nước có tẩm etanol 70% đựng trong chai; găng tay vô trùng; kẹp vô trùng; kéo vô trùng; thùng xốp bảo quản mẫu với túi đá lạnh.
- Cách tiến hành
Lấy mẫu bằng cách dùng miếng gạc hoặc mút vơ trùng (kích thước 10cm x 10cm) lau thân thịt, sử dụng 10ml dung dịch pha loãng nước muối pepton
(0,1% pepton + 0,85% NaCl) vô trùng làm ẩm miếng gạc, miếng mút hay tăm bông trước khi lấy mẫu. Vùng lấy mẫu phải bao trùm tối thiểu 100 cm2 trên một vị trí lấy mẫu. Miếng hấp phụ phải được làm ẩm ít nhất 5 giây trong dung dịch pha lỗng. Sử dụng khn lấy mẫu định vị kích thước 10cm x 10cm và dùng kẹp vô trùng đặt miếng hấp phụ vào khuôn, sau đ di kẹp vô trùng trên bề mặt miếng hấp phụ theo chiều dọc, ngang, chéo trong khn mỗi chiều 10 lần, khơng ít hơn 20 giây. Cho miếng hấp phụ vào túi bằng chất dẻo vô trùng, thêm tiếp lượng dung dịch pha lỗng nước muối pepton vơ trùng sao cho đủ 25ml.
b. Kỹ thuật lấy mẫu nước
- Chỉ tiêu kiểm tra: Kiểm tra TSVKHK, E. coli. - Môi trường bảo quản, vật liệu và dụng cụ lấy mẫu
Chai vơ trùng có thể tích đủ để chứa mẫu xét nghiệm; thùng chứa mẫu (có đá để bảo quản).
- Cách tiến hành
Lấy mẫu tại các vòi nước, thời gian xả nước từ 2 – 3 phút trước khi lấy mẫu, lấy với lượng 300 ml. Sau đ đậy kín bình chứa mẫu và bảo quản ở nhiệt độ 50C - 200C và vận chuyển đến phịng thí nghiệm trong vịng 8 giờ.
c. Kỹ thuật lấy mẫu bằng phương pháp lau bề mặt dụng cụ kinh doanh
- Chỉ tiêu kiểm tra: kiểm tra các chỉ tiêu VSV như: TSVKHK, E. coli, Salmonella.
- Môi trường bảo quản, vật liệu và dụng cụ lấy mẫu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dung dịch pha loãng nước muối pepton vô trùng (0,1% pepton + 0,85% NaCl), được phân phối vào ống phancon với lượng 15 ml; miếng gạc/mút vô trùng; khn lấy mẫu vơ trùng kích thước 10cm x 10cm, có diện tích trống bên trong 100cm2; etanol 70%/bơng thấm nước có tẩm etanol 70% đựng trong chai; găng tay vô trùng; kẹp vô trùng; thùng xốp bảo quản mẫu với túi đá lạnh.
- Cách tiến hành
Làm ẩm miếng gạc trước khi lấy mẫu bằng cách sử dụng 1 ml dung dịch pha lỗng nước muối pepton vơ trùng. Sau đ cọ xát trên một diện tích bề mặt 100 cm2 trong lịng khn lấy mẫu vơ trùng. Diện tích mẫu được lau theo chiều ngang, chiều dọc và đường chéo khoảng 10 lần theo mỗi hướng. Cho miếng gạc vào ống phancon, bảo quản ở nhiệt độ 20C ± 20C và vận chuyển đến phịng thí nghiệm trong vịng 24 giờ.
d. Kỹ thuật lấy mẫu bằng phương pháp lau bề mặt phương tiện vận chuyển
- Chỉ tiêu kiểm tra: kiểm tra các chỉ tiêu VSV như: TSVKHK, E. coli Salmonella.
- Môi trường bảo quản, vật liệu và dụng cụ lấy mẫu
Dung dịch pha lỗng nước muối pepton vơ trùng (0,1% pepton + 0,85% NaCl), được phân phối vào ống phancon với lượng 15 ml; miếng gạc/mút vô trùng; khuôn lấy mẫu vơ trùng kích thước 10cm x 10cm, có diện tích trống bên trong 100cm2; etanol 70%/bơng thấm nước có tẩm etanol 70% đựng trong chai; găng tay vơ trùng; kẹp vô trùng; thùng xốp bảo quản mẫu với túi đá lạnh.
- Cách tiến hành
Làm ẩm miếng gạc trước khi lấy mẫu bằng cách sử dụng 1 ml dung dịch pha lỗng nước muối pepton vơ trùng. Sau đ cọ xát trên một diện tích bề mặt 100 cm2 trong lịng khn lấy mẫu vơ trùng. Cọ xát tại 05 vị trí, 04 góc và giữa đáy phương tiện vận chuyển. Diện tích mẫu được lau theo chiều ngang, chiều dọc và đường chéo khoảng 10 lần theo mỗi hướng. Cho miếng gạc vào ống phancon, bảo quản ở nhiệt độ 20C ± 20C và vận chuyển đến phịng thí nghiệm trong vịng 24 giờ.
e. Kỹ thuật lấy mẫu thịt lợn mảnh
- Chỉ tiêu kiểm tra: kiểm tra các chỉ tiêu VSV như: E. coli, Salmonella. - Môi trường bảo quản, vật liệu và dụng cụ lấy mẫu
Dụng cụ cắt (dao, kéo) hoặc khoan, găng tay vô trùng; kẹp vô trùng; túi bảo quản mẫu vô trùng; thùng xốp bảo quản mẫu với túi đá lạnh.
- Cách tiến hành
Sử dụng dụng cụ khoan hoặc cắt vô trùng, khoan (cắt) miếng mô mỏng, diện tích 5cm2 và độ dày tối đa 5mm. Tổng diện tích cắt từ 20cm2 đến 25cm2, tương đương 200g đến 300g thịt. Gộp các niếng mô vừa cắt thành một mẫu, cho vào túi đựng mẫu vô trùng hoặc đựng trong túi dùng để pha loãng và đồng nhất mẫu. Bảo quản ở nhiệt độ 20C ± 20C và vận chuyển đến phịng thí nghiệm trong vịng 24 giờ.
3.3.4.2. Phương pháp kiểm tra các chỉ tiêu VSV
a. Xác định TSVKHK theo ISO 6222:1999 (TCVN 4884:2005) Nguyên lý:
Trên môi trường thạch PCA trong điều kiện hiếu khí ở 37oC sau 24 - 72 giờ, các VSV hiếu khí có khả năng phát triển và hình thành những khuẩn lạc riêng rẽ. Do đ , c thể đếm số khuẩn lạc trên môi trường thạch PCA để xác định số lượng VSV có chứa trong 1gam mẫu phân tích và được biểu diễn dưới dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc CFU trong một đơn vị khối lượng thực phẩm.
Cách tiến hành: Dùng phương pháp đổ đĩa.
Với mỗi mẫu xét nghiệm phải ni cấy ít nhất ở 3 độ pha loãng liên tiếp, mỗi độ pha lỗng được cấy trên 2 đĩa petri vơ trùng.
Dùng pipet vô trùng chuyển 1 ml dung dịch mẫu ở các độ pha loãng tương ứng vào giữa các đĩa petri trống vơ trùng.
Rót vào mỗi đĩa khoảng 15 ml mơi trường Plate Count Agar (PCA) đã đun tan chảy và được làm nguội đến nhiệt độ 44 - 47oC. Xoay nhẹ đĩa theo chiều kim đồng hồ hoặc lắc sang trái và phải một cách nhẹ nhàng để cho mẫu tan đều vào môi trường.
Đặt đĩa trên mặt phẳng ngang để thạch đơng tự nhiên ở nhiệt độ phịng, lật úp các đĩa và đặt vào tủ ấm 37oC ni ấm đến 72 giờ.
Tính kết quả:
Chọn tất cả các đĩa c khuẩn lạc mọc riêng rẽ và có số khuẩn lạc nằm trong khoảng từ 15 đến 300 khuẩn lạc/đĩa để đếm. Độ pha lỗng càng cao thì số khuẩn lạc càng ít do đ sự phân bố khuẩn lạc trên các đĩa nuôi cấy phải hợp lý. Nếu kết quả khơng hợp lý thì phải tiến hành các bước nuôi cấy lại.
TSVKHK trong 1g mẫu được tính theo cơng thức:
Trong đ :
X: TSVKHK trong 1 gam thịt (CFU/g)
C: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa ở 2 độ pha loãng liên tiếp. n1: Là số đĩa ở độ pha loãng thứ nhất được đếm.
n2: Là số đĩa ở độ pha loãng thứ 2 được đếm.
d : Hệ số pha loãng với độ pha loãng thứ nhất được đếm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
số khuẩn lạc của mỗi độ pha lỗng và kết quả là trung bình số học của 2 giá trị thu được.
- Nếu 2 đĩa ni cấy ứng với độ pha lỗng 10-1 có số khuẩn lạc < 15 thì:
- Nếu 2 đĩa ni cấy ở độ pha lỗng 10-1 khơng có khuẩn lạc nào thì:
Với: m là trung bình của số khuẩn lạc ở 2 đĩa. d là độ pha loãng của huyễn dịch ban đầu, d = 10-1.
Cách biểu thị kết quả: Số thập phân từ 1.00 đến 9.99 nhân với số mũ tương ứng, ví dụ 1,56×104
CFU/g.
b. Xác định vi khuẩn E. coli theo TCVN 7924-2:2008 Nguyên lý:
E. coli dương tính - glucuronidaza. Vi khuẩn ở nhiệt độ 44°C hình thành
các khuẩn lạc màu xanh điển hình trên mơi trường trypton - mật - glucuronid (TBX). Dựa vào đặc tính này ta có thể phát hiện và định lượng được vi khuẩn
E. coli.
Cách tiến hành:
Cấy ở 3 độ pha loãng 10-1; 10-2; 10-3, mỗi độ pha lỗng ni cấy trên 2 đĩa môi trường. Dùng pipet vô trùng chuyển 1 ml dung dịch mẫu ở các độ pha loãng tương ứng vào giữa các đĩa petri vô trùng. R t vào mỗi đĩa khoảng 15 ml môi trường TBX đã đun tan chảy và được làm nguội đến nhiệt độ 44 - 47°C. Xoay nhẹ đĩa theo chiều kim đồng hồ hoặc lắc sang hai bên để cho mẫu tan đều vào môi trường, để đơng tự nhiên ở nhiệt độ phịng trên mặt phẳng nằm ngang. Lật ngược các đĩa, nếu cần ủ ấm các đĩa này ở 37°C/4 giờ sau đ chuyển sang ủ ấm ở 44°C/18 – 24 giờ.
Tính kết quả:
Chọn các đĩa c chứa ít hơn 150 khuẩn lạc điển hình của E. coli dương
tính glucuronidaza và ít hơn 300 khuẩn lạc tổng số trên mỗi đĩa thạch
Trong đ :
N: Số khuẩn lạc E. coli trong 1 gam thịt (CFU/g)
a: Là tổng số các khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa được giữ lại sau 2 độ pha lỗng liên tiếp, có ít nhất 1 đĩa chứa tối thiểu 15 CFU màu xanh.
n1: Số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ nhất. n2: Số đĩa được giữ lại ở độ pha lỗng thứ hai.
V: Thể tích mẫu cấy đã dùng trên mỗi đĩa, tính bằng ml.
d: Hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất được giữ lại (d = 1 trong trường hợp các mẫu ở dạng lỏng khi mẫu thử được cấy trực tiếp).
- Nếu đĩa chứa ít hơn 10 khuẩn lạc, nhưng c ít nhất 4 khuẩn lạc, thì tính kết quả theo trường hợp chung ở trên và báo cáo kết quả là số ước tính nhân với VSV trong 1ml hoặc 1g sản phẩm.
- Nếu tổng số khuẩn lạc từ 3 đến 1, thì độ chụm của kết quả là quá thấp và kết quả phải được ghi như sau: “có mặt VSV nhưng nhỏ hơn (4 × d) trên 1g hoặc 1ml”.
- Trong trường hợp ở nồng độ đầu tiên khơng có khuẩn lạc đặc trưng nào mọc lên thì tổng số E. coli được biểu thị kết quả như sau: “ít hơn 1/d VSV trong 1ml” (sản phẩm dạng lỏng) hoặc “ ít hơn 1/d VSV trong gam” (sản phẩm dạng khác).
Với d là hệ số pha loãng mẫu của huyền phù ban đầu hoặc độ pha loãng thứ nhất đã cấy hoặc giữ lại.
c. Xác định vi khuẩn Salmonella theo TCVN 4829:2005 Nguyên lý:
Quá trình phát hiện Salmonella trong thực phẩm cần qua 4 giai đoạn kế
tiếp nhau: (1) Tăng sinh sơ bộ mẫu đã được đồng nhất để đảm bảo phát hiện một lượng nhỏ hoặc Salmonella đã bị suy giảm hoạt tính → (2) Tăng sinh chọn lọc ở mơi trường lỏng → (3) Phân lập nhằm tách và nhận dạng Salmonella khỏi các quần thể VSV khác trong mẫu → (4) Khẳng định đặc tính sinh hóa, huyết thanh học. Một số môi trường đặc đổ đĩa sử dụng để phân lập Salmonella như: thạch XLD, HE, ... Mỗi mơi trường giúp nhận dạng các lồi thuộc giống này dựa trên các đặc tính sinh hố đặc trưng tương ứng.
Cách tiến hành:
- Tăng sinh sơ bộ: Cân 25g mẫu trung bình đã cắt nhỏ vào túi PE vô trùng chuyên dụng, bổ sung thêm 225ml dung dịch đệm peptone, đồng nhất bằng máy dập mẫu Stomacher ở tốc độ 260 vòng/phút trong 1 phút thu huyễn dịch có nồng độ 10-1.Ủ huyễn dịch mẫu đã đồng nhất ở độ pha loãng 10-1 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
trong tủ ấm 37°C/18±2 giờ.
- Tăng sinh chọn lọc: Tiến hành trên 2 môi trường RVS và MKTTn
Chuyển 0,1ml dung dịch tiền tăng sinh vào ống nghiệm chứa 10ml môi trường RVS, ủ ở 41,5°C/24 giờ.
Chuyển 1ml dung dịch tiền tăng sinh vào ống chứa 10ml môi trường MKTTn, ủ 37°C/24 giờ.
- Phân lập trên môi trường đặc chọn lọc và nhận dạng:
Sau khi ủ, sử dụng dịch tăng sinh chọn lọc trên ria cấy lên bề mặt thạch đĩa XLD và HE.
Lật úp các đĩa đặt trong tủ ấm 37°C/24 giờ. - Khẳng định:
Nếu trên môi trường XLD hình thành khuẩn lạc màu hồng, trung tâm khuẩn lạc màu đen thì nghi là Salmonella.
Nếu trên mơi trường HE hình thành khuẩn lạc màu đen thì nghi là
Salmonella.
Đánh dấu các khuẩn lạc Salmonella nghi trên mỗi đĩa. Ria cấy khuẩn lạc
điển hình trên lên bề mặt đĩa thạch máu. Ủ ấm ở 37°C/24 giờ để thu được khuẩn lạc thuần nhất. Các khuẩn lạc thuần này được dùng để để khẳng định các tính chất sinh vật hoá học trên hệ thống VITEK 2 compact và làm phản ứng huyết thanh học với kháng huyết thanh O, H đa giá. Trước khi làm phản ứng huyết thanh học cần kiểm tra khả năng tự ngưng kết của vi khuẩn. Nếu phản ứng tự ngưng kết âm tính ta tiếp tục tiến hành phản ứng ngưng kết với KHT O, H.
3.3.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Kết quả được tính tốn và xử lý thống kê theo phương pháp thống kê sinh học, sử dụng phần mềm Excel 2013.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. THỰC TRẠNG VỆ SINH THÚ Y TẠI CÁC CHỢ KINH DOANH THỊT LỢN TRÊN ĐỊA BÀN HUYỆN KHOÁI CHÂU THỊT LỢN TRÊN ĐỊA BÀN HUYỆN KHỐI CHÂU
4.1.1. Tình hình phân bố các chợ xây dựng theo mơ hình của Dự án LIFSAP trên địa bàn huyện Khoái Châu trên địa bàn huyện Khoái Châu
Trên địa bàn huyện Khối Châu có tất cả 05 chợ được xây theo mơ hình của Dự án LIFSAP, 05 chợ này nằm ở 05 xã khác nhau; chợ buôn bán các sản phẩm có nguồn gốc từ động vật. Các sản phẩm thịt tại các chợ này đều có nguồn cung cấp từ các hộ kinh doanh, giết mổ thịt gia súc khác nhau hoặc do các đầu mối từ các huyện, tỉnh lân cận như Kim Động, Mỹ Hào, thành phố Hà Nội ... cung cấp sang. Để làm rõ ràng hơn lợi ích của Dự án LIFSAP, ở đề tài này chúng tôi khảo sát thêm 3 chợ thuộc huyện Khối Châu nằm ngồi vùng nâng cấp của dự án là chợ An Vĩ, xã An Vĩ; chợ Đại Tập, xã Đại Tập và chợ Mốc Đá, xã Tứ Dân.
Bảng 4.1. Số lượng điểm tiêu thụ thịt lợn trên địa bàn huyện Khoái Châu