2.2.6.1. Các xét nghiệm cận lâm sàng thông thường bao gồm sinh hóa,
huyết học, Xquang, siêu âm… đƣợc thực hiện tại các khoa phòng tƣơng ứng của Bệnh viện Bạch Mai.
2.2.6.2. Xét nghiệm phát hiện và định lượng các tự kháng thể
a. Kháng thể kháng nhân (KTKN) và kháng dsDNA
Đƣợc phát hiện và định lƣợng bằng phƣơng pháp hấp thụ miễn dịch gắn men (ELISA) trên máy bán tự động Imark® của Hãng BIO-RAD, sử dụng kit của Hãng DRG.
Địa điểm thực hiện tại phòng xét nghiệm miễn dịch của Trung tâm Dị ứng - Miễn dịch Lâm sàng BV Bạch Mai.
Nguyên lý chung: đƣợc thực hiện theo kỹ thuật ELISA Sandwich. Kháng nguyên tinh khiết đƣợc gắn vào các giếng trên bản nhựa. Quá trình gắn giữa kháng nguyên – kháng thể và phản ứng tạo màu enzyme gồm 3 pha:
+ Pha 1: Mẫu chứng và mẫu bệnh phẩm pha loãng đƣợc nhỏ vào các
giếng của phiến nhựa. Các kháng thể có mặt bất kỳ sẽ kết hợp với các kháng nguyên cố định. Sau 1 thời gian ủ nhất định phiến nhựa đƣợc rửa sạch với dung dịch đệm để loại bỏ các thành phần không phản ứng của huyết thanh.
+ Pha 2: Hỗn hợp của kháng kháng thể ngƣời IgG-IgG, kháng kháng thể ngƣời IgG-IgM và kháng kháng thể ngƣời IgA-IgG kết hợp với chất liên kết (Horseradish peroxidase - HRP) đƣợc nhỏ vào các giếng để phát hiện các tự kháng thể gắn kết với các kháng nguyên cố định. Sau 1 thời gian ủ nhất định, enzyme liên kết thừa sẽ đƣợc rửa bằng dung dịch đệm.
Pha 3: Một dung dịch cơ chất màu chứa TMB (3,3',5,5'- Tetramethylbenzidine) sẽ đƣợc đƣa vào các giếng. Trong quá trình ủ màu sắc của dung dịch sẽ thay đổi. Bổ sung chất dừng phản ứng (thƣờng là acid) để kết thúc phản ứng sẽ làm thay đổi màu sắc các giếng. Mức độ của màu sắc sau khi cho chất dừng phản ứng đƣợc đo mật độ quang tại bƣớc sóng 450 nm.
Bƣớc 1 Pha loãng bệnh phẩm Bƣớc 2 Nhỏ bệnh phẩm vào giếng Bƣớc 3 Rửa Bƣớc 4 Nhỏ chất liên kết Bƣớc 5 Rửa Bƣớc 6 Nhỏ cơ chất Bƣớc 7 Nhỏ dung dịch dừng Bƣớc 8 Đo mật độ quang Pha với nƣớc cất.
Tỷ lệ pha tùy thuộc vào loại kit sử dụng. Nhỏ 100µl bệnh phẩm pha loãng và
chứng dƣơng, chứng âm vào các giếng Ủ trong 30 phút ở nhiệt độ thƣờng. Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa pha
loãng
với nƣớc cấ t (tỷ lệ pha loãng của dung dịch rửa tùy thuộc loại kit).
Nhỏ 100µl dd enzyme liên kết vào mỗi giếng.
Ủ 15 phút ở nhiệt độ thƣờng
•
• Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa pha loãng với nƣớc cất.
Nhỏ 100µl dung dịch cơ chất TMB vào mỗi giếng Ủ 15 phút ở nhiệt độ thƣờng. Nhỏ 100µl dung dịch dừng vào mỗi giếng Ủ 5 phút ở nhiệt độ thƣờng Đo mật độ quang ở bƣớc sóng 450nm Tính toán kết quả
Chuẩn bị bệnh phẩm: lấy 2ml máu tĩnh mạch vô trùng không chống đông, bảo quản ở nhiệt độ 80 C, chuyển đến phòng xét nghiệm trong vòng 2 giờ.
Các bƣớc tiến hành: theo sơ đồ 2.2
Đánh giá kết quả: theo chuẩn đánh giá của hãng DRG. Với KTKN: đơn vị tính là mật độ quang (OD)
Âm tính: < 1,2 Dƣơng tính: ≥ 1,2
Với kháng dsDNA: đơn vị tính là IU/ml Âm tính: < 60 IU/ml
b. Kháng thể kháng C1q và kháng nucleosome
Đƣợc phát hiện và định lƣợng bằng phƣơng pháp ELISA trên máy tự động Alegria® của Hãng Orgentec (Đức), sử dụng kit của Hãng Orgentec.
Địa điểm thực hiện: tại Khoa Xét nghiệm BV Đại học Y Hà Nội. Lấy mẫu và lƣu trữ bệnh phẩm: trong các lần thăm khám có định lƣợng tự kháng thể, tiến hành lấy 2ml máu tĩnh mạch vô trùng, để đông tự nhiên ở nhiệt độ phòng, tách 1ml huyết thanh bằng phƣơng pháp ly tâm trong
vòng 2 giờ sau khi lấy máu. Huyết thanh đƣợc bảo quản trong điều kiện -70oC.
Chuẩn bị bệnh phẩm: mẫu huyết thanh trƣớc khi chạy máy đƣợc rã đông ở nhiệt độ phòng trong khoảng 30 phút. Các mẫu bệnh phẩm cho kết quả vƣợt ngƣỡng sẽ đƣợc xét nghiệm lại với độ pha loãng 5-10 lần.
Qui trình chạy mẫu trên máy Alegria®: thực hiện theo các bƣớc đƣợc trình bày trong sơ đồ 2.3.
Lấy giếng hóa chất ra (Để ở nhiệt độ phòng ít nhất 30 phút)
Ghi vị trí cài trên máy vào mỗi giếng hóa chất của từng bệnh nhân Bật công tắc (phía sau bên phải thân máy)
Bàn phím Bấm nút Start analyze Nhập tên ngƣời làm Enter Ấn Screen Protocol Nhấn chọn vị trí đặt số giếng Bàn phím
Nhập code bệnh nhân Enter
Cho 10µl huyết thanh bệnh nhân vào gi ếng đầu tiên Openlid (Nhấc giá ra và đặt giếng vào vị trí đã cài)
Closelid
Scan Strips (Nhấc giá ra và đặt giếng vào vị trí đã cài)
Phân tích
Shutdown khi ra kết quả Tắt công tắc Sơ đồ 2.3. Qui trình chạy mẫu ELISA trên máy Alegria
Đánh giá kết quả: theo chuẩn đánh giá của hãng Orgentec, đơn vị tính là IU/ml: Kháng nucleosome: Âm tính: < 20 IU/ml Dƣơng tính: ≥ 20 IU/ml Kháng C1q: 10 IU/ml Âm tính: < 10 IU/ml Dƣơng tính: ≥ 10 IU/ml