4. Bố cục của luận văn
2.4. Kỹ thuật nghiên cứu
Phỏng vấn điều tra thông tin
- Điều tra phỏng vấn cá nhân: Tất cả đối tƣợng từ ≥ 15 tuổi tại điểm nghiên cứu, các trƣờng hợp ≥ 5 - < 15 tuổi thì phỏng vấn bố, mẹ hoặc ngƣời giám hộ; - Thu thập các thông tin về dân số học và thông tin liên quan đến nghiên cứu về
Kỹ thuật thực hiện đo hoạt độ enzyme G6PD
Về quy trình thực hành chuẩn (SOPs), quy trình thực hành này mô tả các quy trình xác định hoạt độ enzyme G6PD ở những ngƣời dân tham gia vào nghiên cứu sau khi chấp thuận và ký bản cảm kết nghiên cứu (ICF). Các dụng cụ và thiết bị trong bộ cảm ứng dùng để xét nghiệm gồm:
- Máy phân tích cảm biến sinh học CareStart G6PD, que thử và dung dịch đối chứng [54]. Loại test định lƣợng thực hiện tại chỗ, đo chính xác tổng hoạt độ enzyme G6PD trên mẫu máu toàn phần, cho kết quả trong 4 phút. Máy phân tích đóng gói 1 máy/hộp, 25 que/lọ nhựa. Hệ thống cảm biến trong căn chỉnh nhiệt độ và bộ nhớ lữu trữ lên tới 1.000 kết quả và hệ thống nạp máu tự động;
- Các miếng dán đã ghi nhãn sẵn số ID nghiên cứu và ngày thu thập (thông tin đƣợc viết bằng một cây bút mực không trôi màu đen hoặc màu xanh);
- Găng tay vô trùng chuyên dùng để kỹ thuật viên thực hiện xét nghiệm; - Pipette điều chỉnh đƣợc với các đầu tip dùng một lần 10 µL;
- Ống BD-microtainer EDTA 500µL có chứa 200 - 250µL máu toàn phần; - Túi thu thập găng tay và đầu tip pipette đã qua sử dụng.
Định lƣợng hoạt độ enzyme G6PD đƣợc chuẩn hóa trên nồng độ Hb và nồng độ này cũng đƣợc tính thông qua bộ CareStart™ Hb đồng thời trên cùng mẫu máu (10µL máu chích đầu ngón tay.
Hình 2.2a. Máy đo hoạt độ enzyme G6PD Hình 2.2b. Máy đo nồng độ Hb Giá trị hoạt độ G6PD sẽ đƣợc tính bằng IU/g Hb).
Định lƣợng hoạt độ enzyme G6PD của ngƣời tham gia đƣợc xác định bằng bộ cảm biến CareStartTM
G6PD trong máu toàn phần.
Về quy trình thực hiện do kỹ thuật viên và bác sĩ nghiên cứu của Viện Sốt rét - KST - CT Quy Nhơn và học viên tham gia tiến hành, trƣớc khi thực hành trên đối tƣợng, tham gia tập huấn tại thực địa trƣớc khi triển khai, nên chú ý đọc kỹ tài liệu hƣớng dẫn sử dụng thiết bị cảm biến Care-Start G6PD đi kèm với máy. Tài liệu hƣớng dẫn này giúp hiểu đƣợc quy trình thiết lập máy phân tích và xác định hoạt độ enzyme G6PD của những ngƣời tham gia vào nghiên cứu.
Các bƣớc hƣớng dẫn sử dụng sẽ đi vào chế độ thiết lập, đặt giờ, ngày, tháng, năm, âm lƣợng của âm thanh cảnh báo. Trƣớc khi xét nghiệm một mẫu máu, kỹ thật viên phải làm quen hƣớng dẫn sử dụng có giải thích các mã của máy phân tích và làm thế nào để thử máy bằng 1 que thử và 1 dung dịch đối chứng;
- Quy trình xét nghiệm nhƣ sau:
+ Chạy test ở mức nhiệt độ môi trƣờng từ 10-40oC;
+ Nhấn cái nút ở giữa hoặc đƣa que vào trong cổng chứa que để bật máy phân tích lên. Tất cả biểu tƣợng sẽ xuất hiện trên màn hình ngay và sau đó mã số sẽ hiểu thị trên màn hình. Nhấn nút ở giữa để vào chế độ đo;
+ Lấy que CareStart G6PD mới từ chai và đóng nắp ngay sau khi lấy;
+ Đƣa que này cùng với nhãn dán G6PD mặt hƣớng lên trên vào cho tới khi nó dừng lại. Một âm thanh bíp phát ra và biểu tƣợng giọt máu sẽ nhấp nháy;
+ Sử dụng pipette điều chỉnh đƣợc đầu tip 100µL, hút 20µL máu đã pha trong ống BD-microtainer EDTA 500µL có chứa 200-250µL máu chích đầu ngón tay của ngƣời tham gia vào trong que thử;
+ Âm thanh bíp sẽ phát ra khi buồng máu (5µL) của que chứa giọt máu; + Một biểu tƣợng hình chữ nhật sẽ nhấp nháy trên màn hình và sau đó phép đo sẽ đƣợc tiến hành tự động với tiếng bíp phát ra. Việc đếm ngƣợc sẽ bắt đầu từ 240 giây. Khi đồng hồ đếm ngƣợc về 1, kết quả test sẽ xuất hiện cùng với một đơn vị (U/dL) trên màn hình và sẽ đƣợc bộ nhớ máy phân tích lƣu lại;
+ Nhấn vào nút đẩy ra ở phía sau của máy phân tích để tháo que thử đã dùng khỏi máy phân tích. Để tắt máy phân tích, nhấn và giữ nút ở giữa trong 3 giây. Chữ “Off” sẽ xuất hiện trên màn hình và máy sẽ tắt.
- Về phiên giải kết quả:
+ Máy phân tích cảm biến sinh học đo tổng hoạt độ enzyme G6PD trong máu toàn phần (IU/dL) và phạm vi của kết quả test: 0-300 U/dL của máu;
+ Hoạt độ G6PD sẽ đƣợc chuyển đối sang U/g Hb để tính ra ngƣỡng lâm sàng đối với các hoạt độ enzyme G6PD thông thƣờng, trung bình và thiếu;
+ Kết quả mỗi ngƣời tham gia sẽ đƣợc ghi vào phiếu kết G6PD và Hb của tên từng ngƣời. Cần phải loại trừ các yếu tố làm sai lệch kết quả trên ngƣời.
Vứt bỏ các que thử sau khi đã mở hộp 3 tháng và chỉ sử dụng các que test phù hợp đi kèm của nhà sản xuất.
Kỹ thuật xác định biến thể thiếu enzyme G6PD
Mẫu máu đƣợc xác định thiếu hụt enzyme G6PD qua điều tra sẽ đƣợc phân tích. Phƣơng pháp phân tích tỷ lệ thiếu enzyme G6PD và các biến thể enzyme G6PD theo quy trình Goo Youn-Kyoung và cộng sự (2014). Tách chiết DNA bằng kit genomic DNA Prep kit theo hƣớng dẫn nhà sản xuất đƣa ra.
Phân tích biến thể G6PD bằng bộ sinh phẩm DiaPlexC G6PD genotyping kit (Asian type; SolGent, Hàn Quốc). Bộ sinh phẩm này có thể phân biệt đƣợc 7 biến thể thƣờng gặp ở các nƣớc trong khu vực Tây Thái Bình Dƣơng trên gen G6PD bằng kỹ thuật sinh học phân tử PCR-RFLP.
Bộ sinh phẩm có thể phân biệt đƣợc 7 biến thể gen G6PD bằng phản ứng sinh học phân tử. Bộ sinh phẩm xác định biến thể gồm:
+ 2 ống hỗn hợp PCR và 1 ống hỗn hợp mồi;
+ 1 ống thang chuẩn DNA và 1 ống chứng dƣơng đột biến;
+ 1 ống chứng dạng dại.
- Thành phần cho một phản ứng PCR nhƣ sau:
+ Mồi hỗn hợp 2
+ Nƣớc khử ion 8,5
+ DNA khuôn 2
- Chu kỳ phản ứng PCR nhƣ sau:
+ Chu kỳ phản ứng 95°C trong 15 phút;
+ 30 chu kỳ bao gồm 95°C trong 30 giây;
+ 60°C trong 30 giây;
+ 72°C trong 40 giây;
+ Cuối cùng là 72°C trong 10 phút.
- Điện di trên gel 2% trong 30 phút cƣờng độ 100 V, nhuộm gel bằng dung dịch redsafe. Kiểm tra kết quả dƣới đèn tử ngoại;
- Kết quả phân tích cụ thể nhƣ sau:
+ Biến thể Vanua Lava: có kích thƣớc 154 bp;
+ Biến thể Mahidol có kích thƣớc: 337 bp; + Biến thể Coimbra có kích thƣớc 234 bp; + Biến thể Viangchan có kích thƣớc 501 bp; + Biến thể Union có kích thƣớc 803 bp; + Biến thể Canton có kích thƣớc 681 bp; + Biến thể Kalping có kích thƣớc 557 bp.
Trƣờng hợp những mẫu phát hiện có nhiều băng thì có thể tiến hành giải trình tự toàn bộ gen G6PD (kích thƣớc khoảng 5,8Kb), đối chiếu với ngân hàng gen để xác định các biến thể khác [47].
Phƣơng pháp PCR-RFLP để phân tích kiểu gen đột biến xác định biến thể enzyme G6PD thực hiện tại Đại học Gyeong San (Hàn Quốc):
Viangchan: Cặp mồi đột biến đƣợc thiết kế bởi Nuchprayoon và cộng sự (2002) 871F: 5’-TGGCTTTCTCTCAGGTCTAG-3’
G6PD10R: 5’-GTCGTCCAGGTACCCTTTGGGG-3’ Kích thƣớc sản phẩm: 126 bp.
487F: 5’-GCGTCTGAATGATGCAGCTCTGAT-3’ 487R: 5’-CTCCACGATGATGCGGTTCAAGC-3’ Kích thƣớc sản phẩm: 104 bp
Union: Cặp mồi đột biến đƣợc thiết kế bởi Huang và cộng sự (1996)
1360F: 5’-ACGTGAAGCTCCCTGACGC-3’
1360R: 5’-GTGAAAATACGCCAGGCCTTA-3’
Kích thƣớc sản phẩm: 214 bp
Canton: Cặp mồi đột biến đƣợc thiết kế bởi Huang và cộng sự (1996)
1376F: 5’-ACGTGAAGCTCCCTGACGC-3’ 1360R: 5’-GTGAAAATACGCCAGGCCTTA-3’ Kích thƣớc sản phẩm: 214 bp Kaiping: 1388F: 5’-ACGTGAAGCTCCCTGACGC-3’ 1388R: 5’-GTGCAGCAGTGGGGTGAACATA-3’ Kích thƣớc sản phẩm: 227 bp
Chu trình PCR đƣợc thực hiện nhƣ dƣới đây: 95°C 5 phút
95°C 45 giây
56°C 45 giây Lặp lại 40 chu kỳ. 72°C 45 giây
72°C 7 phút
Thử nghiệm RFLP: Thực hiện theo bảng dƣới đây:
Bảng 2.1. Biến thể và các enzyme phân cắt giới hạn áp dụng phân tích Biến thể G6PD Enzym phân cắt
giới hạn Ngƣỡng bình thƣờng (bp) Ngƣỡng đột biến (bp) Viangchan Xba I 126 106+20 Mahidol Hind II 104 82+22 Union Hha I 142+45+27 187+27 Canton Afl II 214 194+20 Kaiping Nde I 227 206+21
Điện di và phân tích trên gel agarose 3%.