4. Bố cục của luận văn
1.7. Các biến thể thiếu enzymeG6PD và mức độ nghiêm trọng
Trên các ca có G6PD bình thƣờng, thuốc PQ là rất an toàn, dung nạp tốt với hiệu lực cao trong việc ngăn tái phát P. vivax. Thử nghiệm liều PQ 0,5 mg/kg hàng ngày trong 14 ngày chỉ định theo sau dihydroartemisinin- piperaquine để điều trị sốt rét P. vivax cấp cũng cho thấy an toàn, dung nạp tốt, với hiệu lực chữa khỏi 98% về chặn tái phát. Thuốc PQ sinh ra tán huyết trên
các bệnh nhân thiếu enzyme G6PD khi so sánh thời gian bán hủy của enzyme với mức độ tồn lƣu hoạt độ enzyme G6PD có liên quan đến các biến thể di truyền G6PD. Về cơ bản, độ nặng của thiếu enzyme G6PD đƣợc phân loại nhẹ hay trầm trọng, phần lớn lệ thuộc vào sự giảm hoạt tính của enzyme G6PD liên quan đến mỗi biến thể.
Vào những năm 1980, TCYTTG đã đƣa ra một phân loại mà trong đó xác định các biến thể thiếu G6PD hay gặp hoặc là lớp II (hoạt độ <10% so với bình thƣờng) hay lớp III (hoạt độ >10% so với bình thƣờng). Loại prototype của lớp II là G6PD Mediterranean và prototype của lớp III là G6PD A- (biến thể châu Phi phổ biến). Phân loại các biến thể khác nhƣ lớp II hay lớp III thƣờng dựa trên một vài mẫu thử tại các la bô khác nhau. Liên quan giữa hoạt độ enzyme và tính nhạy cảm với tán huyết cấp là dựa trên một số lƣợng nghiên cứu tƣơng đối nhỏ trên các ngƣời lớn trƣởng thành khỏe mạnh dùng với PQ.
Một số nghiên cứu lâm sàng chỉ ra thuốc PQ trên các cá nhân có biến thể A- hay Mediterranean rằng loại biến thể A- bị tan huyết khoảng 30% trên hồng cầu trong một tuần dùng thuốc PQ liều 0,5 mg/kg hàng ngày, nhƣng sau đó bình phục trở về lƣợng haematocrite ban đầu và duy trì mức này dù vẫn đang dùng liều đó trong nhiều tuần nữa. Sự bù trừ này đƣợc giải thích do ngẫu nhiên mà ở đó các hồng cầu già nhất bị phá hủy và rồi đƣợc thay thế bởi các quần thể hồng cầu dung nạp tốt với thuốc PQ, điều này biểu hiện dung nạp ngay cả khi dùng liều cao PQ liên tục (30 mg mỗi ngày). Trong khi đó, ngƣời có biến thể Mediterranean không biểu hiện dung nạp vì nhiều hồng cầu non hơn có hoạt độ enzyme G6PD tồn lƣu không đủ chống lại với các sang chấn oxy hóa của PQ, kết quả là thiếu máu tan máu xảy ra nghiêm trọng hơn và không thể tự giới hạn đƣợc. Do đó, dù có đa dạng về mức độ thiếu enzyme G6PD, nguy cơ tán huyết do dùng PQ cũng nên cân nhắc và để ý đến tất cả các biến thể G6PD.
Liều dùng PQ hàng ngày nhƣ hiện nay đƣợc coi là tƣơng đối an toàn trên các bệnh nhân biến thể African A- là hoàn toàn không đúng, vì diện rộng đặc
tính của các biến thể A- thƣờng xem là nhẹ và tự giới hạn có thể khác nhau từ một số nghiên cứu cỡ mẫu nhỏ, hơn nữa trên các cá nhân là nam giới tình nguyện khỏe mạnh. Có 3 type G6PD A- ở châu Phi và ngƣời ta không biết kiểu gen nào trên các cá nhân là khó cho việc dùng PQ qua các nghiên cứu tiến hành những năm 1950 và 1960 (dù kiểu gen phổ biến nhất thƣờng là có sự thay thế nucleotide G202A). Ngoài ra, có hai ca tử vong ở Brazil bị quy kết tan máu là do dùng PQ, cả hai đều đƣợc giải phẩu tử thi và có biến thể A-. Do đó, phân loại các biến thể thiếu G6PD nhƣ nhẹ và nghiêm trọng nhằm đƣa ra quyết định trên lâm sàng và các nhà khoa học cho rằng liều hàng ngày PQ 0,5 mg/kg trong 14 ngày có thể tiềm năng gây tán huyết cấp trên các bệnh nhân có biến thể G6PD là A-. Ngoài ra, trong việc giám sát dƣợc cảnh giác vẫn còn giới hạn ở các quốc gia có bệnh lƣu hành, một số lƣợng tƣơng đối nhỏ ấn bản về tác hại nghiêm trọng khi kê đơn PQ mà không có test G6PD vì không thấy các nguy cơ tiềm tàng này. Một số định nghĩa sau đây đƣợc đƣa ra sau khi cân nhắc kỹ của nhóm chuyên gia về thiếu enzyme G6PD của Tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2016): - Trên nam giới: Bất cứ ngƣời nam nào có hoạt độ G6PD trên HC < 30% so với trị số trung bình bình thƣờng đƣợc coi là thiếu G6PD. Ngƣời ta ƣớc tính đối tƣợng này bán dị hợp đối với một alen thiếu G6PD. Bất cứ ngƣời nam nào có hoạt độ enzyme G6PD từ 30% trở lên so với mức trung bình đƣợc coi là G6PD bình thƣờng và ngƣời ta coi đó là bán dị hợp alen G6PD bình thƣờng;
- Trên nữ giới: Bất cứ ngƣời nữ nào có hoạt độ G6PD hồng cầu dƣới 30% mức trung bình bình thƣờng đƣợc coi là thiếu enzyme G6PD. Khi đó, ngƣời ta đoán chừng hoặc là ngƣời đó có đồng hợp tử alen thiếu G6PD, hoặc có đột biến hai alen (chẳng hạn alen Viangchan và một alen Mahidol), hoặc ngƣời đó có dị hợp tử alen thiếu G6PD, trong đó quần thể hồng cầu thiếu G6PD nổi trội hơn. Bất cứ ngƣời nữ nào có hoạt độ G6PD trên hồng cầu từ 80% trở lên so với mức trung bình hay trung vị bình thƣờng đƣợc coi là mức G6PD bình thƣờng. Ngƣời ta ƣớc tính rằng ngƣời đó hoặc là đồng hợp tử đối với alen G6PD bình thƣờng hoặc là
dị hợp tử của một alen thiếu G6PD và một alen G6PD bình thƣờng, trong đó quần thể hồng cầu có mức G6PD bình thƣờng nổi trội hơn. Bất cứ phụ nữ nào có mức hoạt độ enzyme G6PD từ 30-80% so với mức G6PD bình thƣờng thì coi nhƣ là loại bán thiếu enzyme G6PD; ƣớc tính ngƣời đó có dị hợp tử với alen thiếu G6PD và một alen G6PD bình thƣờng.
Hơn 10 năm qua, xét nghiệm phát hiện phát quang (fluorescent spot test- FST) đã đƣợc coi là test định tính sàng lọc thiếu enzyme G6PD. TCYTTG chấp nhận một loại test định tính G6PD mới ít nhất là tƣơng đƣơng kết quả với FST trong thực hành, vì đây là một test thƣơng mại đã đƣợc dùng rộng rãi tại các la bô lâm sàng, ngân hàng máu và các bệnh về máu nhƣ an toàn truyền máu. Tuy nhiên, quy trình rất phức tạp và đòi hỏi kỹ năng la bô và trang thiết bị cùng với dây chuyền lạnh cho các thuốc thử, đồng thời các test định tính sẽ không phù hợp để phát hiện các thể dị hợp thiếu enzyme G6PD ở nữ, nên sẽ có nguy cơ tan máu cấp khi dùng PQ dài ngày, đồng thời test định tính sẽ không phát hiện mức độ thiếu và bán thiếu. Điều đó sẽ không khả thi để sử dụng thƣờng quy tại các vùng nhiệt đới, đặc biệt là các cơ sở y tế xa xôi mà ở đó bệnh nhân sốt rét đang có mặt và cần chẩn đoán, nên nhu cầu cần có công cụ định lƣợng tốt hơn và dễ sử dụng và không cần thiết bị phức tạp và phiên giải kết quả nhanh là rất thiết thực.
Trong trƣờng hợp tình trạng thiếu enzyme G6PD không đƣợc biết và test không có sẵn thì quyết định kê đơn PQ hàng ngày để ngăn ngừa tái phát xa phải dựa trên đánh giá sau: (i) Dữ liệu về tỷ lệ thiếu enzyme G6PD trên quần thể tại chỗ, (ii) Khả năng xác định và giám sát an toàn và quản lý sự tán huyết do dùng PQ điều trị, (iii) Lợi điểm của việc điều trị để giảm số tái phát. Bệnh nhân mắc sốt rét cấp do P. vivax hay P. ovale mà tình trạng enzyme G6PD không biết nhƣ thế nào thì có thể dùng liều hàng tuần 0,75 mg/kg/tuần trong 8 tuần dƣới sự giám sát chặt chẽ về các triệu chứng thiếu máu tan máu cấp trong 3 tuần đầu dùng thuốc.
Chƣơng 2
ĐỔI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Địa điểm:
Nghiên cứu sẽ đƣợc tiến hành tại địa bàn ba xã có sốt rét lƣu hành phức tạp và thƣờng xuyên biến động, gồm xã Ea Dăh, Đliê Ya, Ea Puk, thuộc huyện Krông Năng, tỉnh Đắk Lắk. Đây là huyện có số bệnh nhân sốt rét cao nhất tỉnh Đăk Lăk năm 2019-2020. Tỉnh Đăk Lăk nằm ở Tây Nguyên Việt Nam với tổng dân số 1.872.228 ngƣời trong năm 2019. Tỉnh này nằm ở phía tây và cuối dãy Trƣờng Sơn, là một cao nguyên rộng lớn, địa hình khá bằng phẳng, dốc thoải, có hƣớng thấp dần từ đông nam sang tây bắc và xen kẽ với các đồng bằng thấp ven theo các sông chính.
Hình 2.1. Địa điểm nghiên cứu 3 xã thuộc huyện Krông Năng, tỉnh Đăk Lăk
Huyện Krông Năng bao phủ diện tích 615 km² với tổng dân số khoảng 127.000 ngƣời. Huyện này tiếp giáp huyện Krông Pa, tỉnh Gia Lai ở phía bắc, huyện Ninh Hòa, tỉnh Khánh Hòa, và huyện Sông Hinh, Phú Yên ở phía đông.
Hai huyện này có năm nhóm dân tộc thiểu số H’Mông, Ê Đê, Tày, Thái.
Nguồn thu nhập chính của những ngƣời dân sống trong huyện này từ nông nghiệp bao gồm trồng lúa gần nhà hoặc ở trong rừng và sản xuất đồ nội thất trang trí và nghệ thuật. Huyện có 11 trạm y tế thuộc TTYT huyện. Trong năm 2020, dân số xã Ea Dah, Dliê Ya và Ea Puk lần lƣợt là 8.274; 16.207 và 4.935 ngƣời.
Mỗi năm có hai mùa khác nhau rõ rệt trong huyện Krông Năng: mùa mƣa kéo dài từ tháng 7 đến cuối tháng 12; mùa khô bắt đầu từ tháng 1 đến cuối tháng 6. Việc triển khai điều tra trong 6 tháng đầu tiên năm 2021 tại 3 xã, song song đó phân tích các mẫu thiếu enzyme G6PD về biến thể của G6PD.
- Thời gian
Từ tháng 01 đến tháng 9 năm 2021
2.2. Đối tƣợng nghiên cứu
Quần thể dân cƣ đang sinh sống và làm việc tại địa bàn các xã Ea Dăh, Đ’Liê Ya, Ea Puk, ngƣời tham gia nghiên cứu với độ tuổi từ 5 tuổi trở lên, không phân biệt giới tính và dân tộc.
Tiêu chuẩn lựa chọn và tiêu chuẩn loại trừ phù hợp chọn mẫu:
2.2.1. Tiêu chuẩn lựa chọn
- Trẻ em từ 5 tuổi trở lên và ngƣời lớn, không phân biệt giới tính, dân tộc;
- Bệnh nhân đồng ý tham gia nghiên cứu hoặc có sự đồng ý của cha mẹ, ngƣời thân hoặc ngƣời giám hộ trong trƣờng hợp là trẻ em;
- Các đối tƣợng này đang sống, học tập, làm việc có địa chỉ tại các xã chọn; - Đồng ý và ký giấy chấp thuận tham gia nghiên cứu.
2.2.2. Tiêu chuẩn loại trừ
- Trẻ em dƣới 5 tuổi (chọn để khả thi trong việc dễ lấy mẫu máu đầu ngón tay và gót chân của trẻ em để xét nghiệm hoạt độ enzyme G6PD);
- Đang mắc bệnh cấp tính, sốt cao, thiếu máu, phụ nữ đang mang thai; - Đối tƣợng không đồng ý tham gia vào nghiên cứu.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu cắt ngang mô tả;
Phân tích định lƣợng hoạt độ enzyme G6PD bằng công cụ cảm biến CareStart™ G6PD biosensor (AccessBio, Mỹ).
2.3.2. Cỡ mẫu
Với tỷ lệ thiếu hoạt độ enzyme G6PD là 8,6% qua nghiên cứu trƣớc đó tại huyện Tuy Đức, tỉnh Đăk Nông, độ nhạy kỳ vọng (ES: Expected Sensitivity) là 0,95; khoảng tin cậy 0,95% (CI95%), độ chính xác d = 0,1 và số trƣờng hợp bị thiếu enzyme ƣớc tính là 94. Cỡ mẫu cần thu thập tại mỗi xã tính theo công thức:
Khi đó cỡ mẫu cần điều tra tại mỗi xã là n1 = n2 = n3 = 1.094 ngƣời Vậy tổng số 3 xã thì cần số mẫu khoảng 1.094 x 3 = 3.282 ngƣời.
2.3.3. Phương pháp chọn mẫu
- Trong 1 xã, chọn chủ đích 2 thôn thƣờng có nhiều bệnh nhân sốt rét đƣợc báo cáo hàng năm, gia đình gần bìa rừng, hoặc có nhiều ngƣời đi rừng, ngủ rẫy; - Trong một xã, lấy danh sách các thôn, làng trong vùng SRLH và chọn chủ
đích 2 thôn, làng cho đến khi đủ cỡ mẫu;
- Từ danh sách các đối tƣợng từ 5 tuổi trở lên ở các thôn, làng đƣợc lựa chọn bằng phƣơng pháp ngẫu nhiên.
2.4. Kỹ thuật nghiên cứu
Phỏng vấn điều tra thông tin
- Điều tra phỏng vấn cá nhân: Tất cả đối tƣợng từ ≥ 15 tuổi tại điểm nghiên cứu, các trƣờng hợp ≥ 5 - < 15 tuổi thì phỏng vấn bố, mẹ hoặc ngƣời giám hộ; - Thu thập các thông tin về dân số học và thông tin liên quan đến nghiên cứu về
Kỹ thuật thực hiện đo hoạt độ enzyme G6PD
Về quy trình thực hành chuẩn (SOPs), quy trình thực hành này mô tả các quy trình xác định hoạt độ enzyme G6PD ở những ngƣời dân tham gia vào nghiên cứu sau khi chấp thuận và ký bản cảm kết nghiên cứu (ICF). Các dụng cụ và thiết bị trong bộ cảm ứng dùng để xét nghiệm gồm:
- Máy phân tích cảm biến sinh học CareStart G6PD, que thử và dung dịch đối chứng [54]. Loại test định lƣợng thực hiện tại chỗ, đo chính xác tổng hoạt độ enzyme G6PD trên mẫu máu toàn phần, cho kết quả trong 4 phút. Máy phân tích đóng gói 1 máy/hộp, 25 que/lọ nhựa. Hệ thống cảm biến trong căn chỉnh nhiệt độ và bộ nhớ lữu trữ lên tới 1.000 kết quả và hệ thống nạp máu tự động;
- Các miếng dán đã ghi nhãn sẵn số ID nghiên cứu và ngày thu thập (thông tin đƣợc viết bằng một cây bút mực không trôi màu đen hoặc màu xanh);
- Găng tay vô trùng chuyên dùng để kỹ thuật viên thực hiện xét nghiệm; - Pipette điều chỉnh đƣợc với các đầu tip dùng một lần 10 µL;
- Ống BD-microtainer EDTA 500µL có chứa 200 - 250µL máu toàn phần; - Túi thu thập găng tay và đầu tip pipette đã qua sử dụng.
Định lƣợng hoạt độ enzyme G6PD đƣợc chuẩn hóa trên nồng độ Hb và nồng độ này cũng đƣợc tính thông qua bộ CareStart™ Hb đồng thời trên cùng mẫu máu (10µL máu chích đầu ngón tay.
Hình 2.2a. Máy đo hoạt độ enzyme G6PD Hình 2.2b. Máy đo nồng độ Hb Giá trị hoạt độ G6PD sẽ đƣợc tính bằng IU/g Hb).
Định lƣợng hoạt độ enzyme G6PD của ngƣời tham gia đƣợc xác định bằng bộ cảm biến CareStartTM
G6PD trong máu toàn phần.
Về quy trình thực hiện do kỹ thuật viên và bác sĩ nghiên cứu của Viện Sốt rét - KST - CT Quy Nhơn và học viên tham gia tiến hành, trƣớc khi thực hành trên đối tƣợng, tham gia tập huấn tại thực địa trƣớc khi triển khai, nên chú ý đọc kỹ tài liệu hƣớng dẫn sử dụng thiết bị cảm biến Care-Start G6PD đi kèm với máy. Tài liệu hƣớng dẫn này giúp hiểu đƣợc quy trình thiết lập máy phân tích và xác định hoạt độ enzyme G6PD của những ngƣời tham gia vào nghiên cứu.
Các bƣớc hƣớng dẫn sử dụng sẽ đi vào chế độ thiết lập, đặt giờ, ngày, tháng, năm, âm lƣợng của âm thanh cảnh báo. Trƣớc khi xét nghiệm một mẫu máu, kỹ thật viên phải làm quen hƣớng dẫn sử dụng có giải thích các mã của máy phân tích và làm thế nào để thử máy bằng 1 que thử và 1 dung dịch đối chứng;
- Quy trình xét nghiệm nhƣ sau:
+ Chạy test ở mức nhiệt độ môi trƣờng từ 10-40oC;
+ Nhấn cái nút ở giữa hoặc đƣa que vào trong cổng chứa que để bật máy phân tích lên. Tất cả biểu tƣợng sẽ xuất hiện trên màn hình ngay và sau đó mã số sẽ hiểu thị trên màn hình. Nhấn nút ở giữa để vào chế độ đo;
+ Lấy que CareStart G6PD mới từ chai và đóng nắp ngay sau khi lấy;
+ Đƣa que này cùng với nhãn dán G6PD mặt hƣớng lên trên vào cho tới khi nó dừng lại. Một âm thanh bíp phát ra và biểu tƣợng giọt máu sẽ nhấp nháy;
+ Sử dụng pipette điều chỉnh đƣợc đầu tip 100µL, hút 20µL máu đã pha trong ống BD-microtainer EDTA 500µL có chứa 200-250µL máu chích đầu ngón tay của ngƣời tham gia vào trong que thử;
+ Âm thanh bíp sẽ phát ra khi buồng máu (5µL) của que chứa giọt máu; + Một biểu tƣợng hình chữ nhật sẽ nhấp nháy trên màn hình và sau đó phép đo sẽ đƣợc tiến hành tự động với tiếng bíp phát ra. Việc đếm ngƣợc sẽ bắt đầu từ 240 giây. Khi đồng hồ đếm ngƣợc về 1, kết quả test sẽ xuất hiện cùng với một