b. Hoạt tính tán huyết
2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc
Phương pháp chung để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất là sử dụng kết hợp giữa các thông số vật lý và các phương pháp phổ hiện đại, bao gồm:
Phổ khối lượng phân giải cao (HR ESI-MS)
Phổ khối lượng HR ESI được đo trên máy Agilent 6510 Q-TOF LC/MS của Viện Hóa sinh hữu cơ Thái Bình Dương (PIBOC), phân viện Viễn Đông - Viện Hàn lâm Khoa học LB Nga.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Các phổ cộng hưởng từ hạt nhân được đo trên máy Bruker DRX 500 và 125.8 MHz (sử dụng Tetramethylsilan làm chất chuẩn nội) của Viện Hóa sinh hữu cơ Thái Bình Dương (PIBOC), phân viện Viễn Đông - Viện Hàn lâm Khoa học LB Nga.
Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng bao gồm:
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT 90º, DEPT 135º.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: HSQC, HMBC, COSY, TOCOSY, NOESY
- Dung môi được sử dụng bao gồm: CD3OD, CDCl3, Pyridin-d5.
Sắc kí khí (GC)
Sắc kí khí được tiến hành trên máy Agilent 6580, khí mang He (1,7 ml/ph), chương trình nhiệt độ 100oC(5ph) – 5oC / 1ph – 250oC (30ph), cột mao quản HP-5 MS (30 m × 0,25 mm), tinl. 150oC, tdet.280oC, của Viện Hóa sinh hữu cơ Thái Bình Dương (PIBOC), phân viện Viễn Đông - Viện Hàn lâm Khoa học LB Nga.
Độ quay cực [α]D :
Độ quay cực được đo trên máy Perkin-Elmer polarimeter Model 343 của Viện Hóa sinh hữu cơ Thái Bình Dương (PIBOC), phân viện Viễn Đông - Viện Hàn lâm Khoa học LB Nga.
Phương pháp Mosher:
Phương pháp được tiến hành theo các bước được đưa ra dưới đây [38]. Các hóa chất CH2Cl2, (R)-MTPA clorua, (S)-MTPA clorua, DMAP do Sigma cung cấp.
Điều chế dạng (S)-MTPA este:
- Hòa mẫu thí nghiệm vào trong CH2Cl2, tiếp đó bổ sung (R)-MTPA clorua và DMAP vào dung dịch và hỗn hợp phản ứng được để qua đêm ở nhiệt độ phòng.
- Sản phẩm phản ứng được làm sạch bằng sắc kí lớp mỏng điều chế trên bản mỏng silica gel sử dụng hệ dung môi n-hexan/EtOAc 4:1, thu được hợp chất (S)- MTPA este.
Điều chế dạng (R)-MTPA este:
- Hòa mẫu thí nghiệm vào trong CH2Cl2, tiếp đó bổ sung (S)-MTPA clorua và DMAP vào dung dịch và hỗn hợp phản ứng được để qua đêm ở nhiệt độ phòng.
- Sản phẩm phản ứng được làm sạch bằng sắc kí lớp mỏng điều chế trên bản mỏng silica gel sử dụng hệ dung môi n-hexan/EtOAc 4:1, thu được hợp chất (R)- MTPA este.
Thủy phân, xác định cấu hình tuyệt đối của các gốc đường [55]:
Hợp chất glycoside (1,0 mg) cho phản ứng với 1ml axit trifluoroacetic 2M (TFA) ởđiều kiện 1000C trong 2 giờ, sau đó, lớp nước được rửa bằng CHCl3 (3 lần x 0.5 ml) rồi đem cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được dịch cô chứa hỗn hợp đường;
Hỗn hợp đường thu được tiếp tục cho phản ứng với 0,5 ml (-)-2-octanol và 1 giọt TFA đậm đặc ởđiều kiện 130 0C trong 6 giờ. Dung dịch sau phản ứng đem cất loại dung môi, bổ sung thêm 0,4 ml hỗn hợp pyridine/acetic anhydride (1:1) để 24h ở nhiệt độ phòng thu được hỗn hợp đường được acetyl hóa. Hỗn hợp này được so sánh với các đường chuẩn, cũng được acetyl hóa theo cách tương tự, bằng phương pháp sắc ký khí (GC).