b. Hoạt tính tán huyết
2.2.3.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế sự thụ tinh và phát triển phôi bào trên loài cầu gai Strongylocentrotus intermedius.
bào trên loài cầu gai Strongylocentrotus intermedius.
- Nguyên liệu:
- Cầu gai đực và cầu gai cái loài Strongylocentrotus intermediusở thời kì sinh sản, được cung cấp bởi trạm nghiên cứu biển, Viện Hóa sinh hữu cơ Thái Bình Dương (PIBOC), phân viện viễn đông-viện Hàn lâm Khoa học LB Nga.
- Nước biển, dung dịch KCl 0,5M, DMSO 1%.
¾ Phương pháp tiến hành thử nghiệm khả năng ức chế sự thụ tinh trên trứng loài cầu gai Strongylocentrotus intermedius:
- Thu thập tinh trùng và trứng của cầu gai: tiêm dung dịch KCl 5% vào khoang bụng của cầu gai đực và cầu gai cái (S.intermedius), sau đó ngâm phần bụng của mỗi loại cầu gai vào các cốc nước biển riêng biệt để thu thập các giao tử.
- Trứng của cầu gai được rửa lại ba lần bằng nước biển và được đưa đến nồng độ 1000 tế bào/ml. Chất thửđược hòa tan trong DMSO 1% ở các nồng độ 5, 10, 25, 50 µM.
- Hai giọt tinh trùng cầu gai được pha trong 25 ml nước biển rồi chuyển 0,9ml dung dịch huyền phù này vào mỗi giếng của phiến 24 giếng.
- Thêm vào mỗi giếng 0,1 ml chất cần thử với nồng độ (5, 10, 25, 50 µM) của các chất khác nhau. Sau 15 phút, bổ sung 1ml dung dịch trứng cầu gai vào mỗi giếng. Tiếp tục để 15 phút, sau đó bảo quản dung dịch trứng bằng formandehit 2%.
Sự thụ tinh được đánh giá dựa trên tỷ số sự có mặt hay không có mặt của một màng thụ tinh hoàn thiện trong mẫu thí nghiệm trên tổng số trứng thử nghiệm. Số lượng trứng đã thụ tinh được đếm bằng kính hiển vi đảo ngược.
Số trứng đã thụ tinh
% Trứng thụ tinh = x 100% ∑ trứng thử nghiệm
¾ Phương pháp tiến hành thử nghiệm hoạt tính ức chế sự phát triển phôi bào 8 của loài cầu gai Strongylocentrotus intermedius.
- 0,9 ml dung dịch trứng đã được thụ tinh được cho vào từng giếng của phiến 24 giếng.
- thêm vào giếng 0,1 ml chất cần thử với nồng độ (5, 10, 25, 50 µM) của các chất khác nhau. Sau đó, các phiến vi lượng với các hợp chất được ủở 18-20 ºC cho đến khi các phôi ở chỗ trống đạt đến giai đoạn phôi tám. Số lượng phôi thai ở giai đoạn phôi tám được đếm bằng kính hiển vi đảo ngược.
Dữ liệu cho mỗi hợp chất được phân tích từ ba phép đo độc lập. Kết quảđược thể hiện như là một tỷ lệ tương đối so với các mẫu chứng. Các hiệu quảức chế nồng độ EC100 và EC50 được tính toán đồ họa bằng cách sử dụng phần mềm SigmaPlot 3,02 (Tập đoàn Jandel, Mỹ).