2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Muỗi Ae. aegypti.
- Hóa chất thử nhạy cảm bao gồm nhóm hóa chất phốt pho hữu cơ (malathion 5%) và nhóm hóa chất pyrethroid (permethrin 0,75%, deltamethrin 0,05%, lambda-cyhalothrin 0,05% , alphacypermethrin 30mg/m2).
- Hóa chất sử dụng để phun ULV bao gồm K-Othrine 2EW, Permethrine 50EC, Malathion 50EC và hóa chất sử dụng để phun mù nóng bao gồm Stmed- Permethrin 50EC và Han-Pec 50EC.
2.1.2. Thời gian nghiên cứu
Thực hiện từ tháng 10/2020 - 8/2021.
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu
2.1.3.1. Nghiên cứu ở thực địa
Nghiên cứu đƣợc thực hiện tại 3 sinh cảnh (địa điểm) khác nhau trên địa bàn tỉnh Bình Định, bao gồm:
- Sinh cảnh thành thị: chọn thành phố Quy Nhơn, nơi có mật độ dân số cao nhất tỉnh, trung bình 1.011,2 ngƣời/km2
[6].
- Sinh cảnh đồng bằng: chọn thị xã An Nhơn, nơi có mật độ dân số trung bình 504 ngƣời/km2 [6].
- Sinh cảnh miền núi: chọn huyện Vân Canh, nơi có mật độ dân số thấp khoảng 31,8 ngƣời/km2 [6].
2.1.3.2. Nghiên cứu ở phòng thí nghiệm
Phòng thí nghiệm khoa Côn trùng, Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Quy Nhơn.
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.2. Nội dung nghiên cứu mục tiêu 1
- Xác định mức độ nhạy của muỗi Ae. aegypti tại các sinh cảnh với các hóa chất diệt côn trùng gồm alphacypermethrin 30mg/m2, lambdacyhalothrin 0,05%, deltamethrine 0,05%, permethrin 0,75% và malathion 5%.
2.2.3. Nội dung nghiên cứu mục tiêu 2
- Đánh giá hiệu lực diệt muỗi Ae. aegypti của hóa chất bằng thử nghiệm phun ULV với hóa chất Malathion 50EC, K-Othrine 2EW và Permethrine 50EC - Đánh giá hiệu lực diệt muỗi Ae. aegypti của hóa chất bằng thử nghiệm phun mù nóng với hóa chất Stmed-Permethrin 50EC và Han-Pec 50EC.
2.2.1. Nội dung nghiên cứu mục tiêu 3
- Xác định cơ chế kháng tập tính của muỗi và bọ gậy Ae. aegypti.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Thiết kế nghiên cứu
- Nghiên cứu tại thực địa: Nghiên cứu ngang mô tả từ 10/2020 - 12/2020
nhằm xác định sự phân bố, tập tính và đặc điểm của muỗi và bọ gậy Ae. aegypti
tại các sinh cảnh đƣợc chọn.
- Nghiên cứu tại phòng thí nghiệm: thời gian từ 10/2020 – 6/2021
Mẫu muỗi và bọ gậy thu thập từ thực địa đƣợc chuyển về khoa Côn trùng, Viện Sốt rét – KST – Côn trùng Quy Nhơn để thử nghiệm độ nhạy và hiệu lực diệt của một số hóa chất đối với muỗi Ae. aegypti.
2.3.2. Cỡ mẫu nghiên cứu
2.3.2.1. Cỡ mẫu và cách chọn mẫu cho điều tra thực địa
- Cỡ mẫu: Mẫu điều tra theo quy trình của Bộ Y tế năm 2014 [4]. Mỗi xã/phƣờng chọn 50 nhà, mỗi sinh cảnh là 100 nhà và 3 sinh cảnh là 300 nhà.
- Cách chọn nhà điều tra: Chọn nhà điều tra theo kỹ thuật “cổng liền cổng” nhƣ sau: Quy định hƣớng đi về bên phải, chọn ngẫu nhiên 1 nhà đầu tiên.
Nhà tiếp theo liền cổng về bên phải và thực hiện cho đến khi đủ 50 nhà. Nếu nhà vắng chủ sẽ quay trở lại điều tra sau, nếu lần 2 vẫn vắng thì sử dụng nhà tiếp theo cuối cùng.
2.3.2.2. Cỡ mẫu và cách chọn mẫu cho kỹ thuật phòng thí nghiệm
- Cỡ mẫu thử nhạy cảm: muỗi cái Ae. aegypti, F1, trƣởng thành. Mỗi hóa chất cần 150 cá thể, trong đó, cho 100 muỗi tiếp xúc với giấy tẩm hóa chất và 50 muỗi cho tiếp xúc với giấy đối chứng (không tẩm hóa chất) [53].
Tổng số cá thể muỗi cái Ae. aegypti cần thiết:
150 cá thể x 5 loại hóa chất x 3 sinh cảnh = 2.250 cá thể
- Cỡ mẫu thử nghiệm hiệu lực diệt với hóa chất: muỗi cái Ae. aegypti, F1, trƣởng thành. Đặt 4 lồng muỗi trong mỗi phòng, mỗi lồng 20 cá thể, ở độ cao: 0,5m, 1m, 1,5m và 1,8m. (lồng có sẵn nƣớc đƣờng glucose 10%) [3].
Tổng số cá thể muỗi cái Ae. aegypti cần thiết:
20 cá thể x 6 nhà x 4 lồng x 5 loại hóa chất x 3 sinh cảnh = 7.200 cá thể
2.4. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu
2.4.1. Kỹ thuật soi bắt muỗi ban ngày
Nhóm điều tra gồm ít nhất ba ngƣời, tiến hành soi bắt muỗi từ 7 giờ đến 17 giờ. Ngƣời điều tra, một tay cầm ống tube hoặc máy bắt muỗi, một tay cầm đèn pin. Bắt đầu tìm muỗi từ cửa ra vào và dần vào trong, đến các phòng, vừa đi vừa rọi đèn vào tƣờng, màn, rèm, quần áo, các vật treo trên tƣờng, dƣới gầm giƣờng, bàn ghế,... [4].
Chú ý những nơi gia đình thƣờng sinh hoạt nhƣ phòng ngủ, phòng khách, nhà tắm và nơi ánh sáng yếu nhƣ nhà kho, góc cầu thang, gầm bàn ghế,... Khi phát hiện muỗi dùng tube úp nhanh, dùng ngón trỏ xuống bịt ống tube lại, sau đó dùng bông nút ống. Mỗi nhà điều tra 15 phút sau đó di chuyển đến nhà tiếp theo. Ghi nhãn gồm địa điểm, thời gian, giá thể đậu và nơi bắt muỗi.
2.4.2. Kỹ thuật điều tra và thu thập bọ gậy Ae. aegypti
Sử dụng bộ dụng cụ điều tra côn trùng để thu thập bọ gậy trong các DCCN ở hộ gia đình điều tra. Quan sát cả trong và xung quanh nhà để ghi nhận các DCCN có hoặc không có bọ gậy, chủng loại DCCN. Bọ gậy thu thập đƣợc chuyển về khoa Côn trùng, Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Quy Nhơn để thực hiện nhân nuôi [4].
2.4.3. Kỹ thuật nhân nuôi muỗi Ae. aegypti
Bọ gậy thu từ thực địa cho vào các khay nuôi và nuôi ở nhiệt độ 250C ± 20C, độ ẩm 80 - 85%, chiếu sáng 10 giờ mỗi ngày. Hằng ngày, kiểm tra và nhặt quăng từ khay cho vào cốc đặt trong các lồng nuôi riêng. Khi quăng lột xác thành muỗi trƣởng thành thì định loại để xác định loài muỗi Ae. aegypti. Muỗi
Ae. aegypti đạt 2-3 ngày tuổi cho đốt chuột nhắt trắng. Sau khi hút máu 2-3 ngày, cho muỗi đẻ vào miếng giấy thấm đặt sẵn trong lồng. Nhân nuôi đến thế hệ F1 và những cá thể muỗi cái khỏe mạnh sẽ đƣợc sử dụng.
2.4.4. Thử nhạy cảm muỗi Ae. aegypti với hóa chất diệt côn trùng
Tiến hành thử nhạy cảm để phát hiện các cá thể còn nhạy, có khả năng kháng hay đã kháng với hóa chất trong quần thể muỗi Ae. aegypti. Thực hiện theo quy trình thử nhạy cảm của WHO năm 2016 [54].
Bảng 2.1. Các hóa chất diệt côn trùng, nồng độ và thời gian thử nghiệm Nhóm hóa chất Tên hóa chất Nồng độ Thời gian
Phốt pho hữu cơ Malathion 5% 1 giờ
Pyrethroid Permethrin Deltamethrin Lambda-cyhalothrin Alphacypermethrin 0,75% 0,05% 0,05% 30mg/m2 1 giờ 1 giờ 1 giờ 1 giờ
- Các loại giấy thử nhạy cảm: Giấy thử tẩm hóa chất diệt côn trùng và giấy đối chứng tẩm dầu do WHO cung cấp đƣợc dùng thử nghiệm (Bảng 2.1).
- Trang thiết bị vật tƣ thử nghiệm:
+ 12 ống nhựa cứng, trong suốt, hình trụ dài 125mm, đƣờng kính 44mm, một đầu ống lắp vào nắp đậy có lƣới nhựa, đầu kia lắp vào tấm đế.
Ống có chấm đỏ: 4 ống, dùng làm ống tiếp xúc.
Ống có chấm xanh: 8 ống, trong đó, có 2 ống dùng làm ống đối chứng.
Tấm đế: 6 tấm (để gắn ống nghỉ với ống tiếp xúc và ống đối chứng). + Giấy nghỉ: 6 tờ (giấy sạch, kích thƣớc 12cm x 15cm)
+ Vòng kim loại: 12 chiếc dùng để giữ cố định giấy thử và giấy nghỉ trong các ống. Gồm 6 vòng bằng thép (dùng cho giấy nghỉ) và 6 vòng bằng đồng (dùng cho giấy thử).
+ Ống hút bằng thủy tinh: 2 cái (dùng để mắt muỗi).
+ Ngoài ra còn cần một số dụng cụ khác nhƣ tube bắt muỗi, khay đựng, bông thấm nƣớc, bông không thấm nƣớc, panh, đồng hồ bấm giờ.
- Điều kiện thử nghiệm:
+ Phòng thử nghiệm phải đảm bảo không tồn dƣ hóa chất. + Nhiệt độ phòng thử từ 250C ± 20C, độ ẩm 80-90%.
+ Muỗi thử nghiệm là muỗi cái Ae. aegypti từ 2-5 ngày tuổi, chƣa hút máu, đã hút đƣờng glucose 10%, khỏe mạnh, cơ thể còn nguyên vẹn. Nếu không đủ số lƣợng thì có thể nuôi và sử dụng thế hệ F1 để thử nghiệm.
+ Mỗi loại hóa chất cần 150 cá thể muỗi cái trƣởng thành khỏe mạnh để thử nghiệm. Trong đó, có 100 muỗi cho tiếp xúc với giấy tẩm hóa chất và 50 muỗi cho tiếp xúc với giấy đối chứng.
* Quy trình thử nghiệm + Bƣớc 1: Chuẩn bị ống nghỉ
Lấy giấy nghỉ ghi số thứ tự của ống thử, tên hóa chất, nồng độ, ngày thử, sau đó cuộn thành hình trụ và lồng vào trong ống nghỉ, dùng vòng để giữ cho tờ giấy ép sát vào thành ống. Lắp ống nghỉ vào tấm đế.
+ Bƣớc 2: Chuẩn bị muỗi thử
Chọn muỗi đủ tiêu chuẩn để thử nghiệm rồi sử dụng tube bắt muỗi trong các lồng muỗi cho vào ống nghỉ, mỗi ống 20 cá thể.
+ Bƣớc 3: Cho muỗi nghỉ
Thả 25 con muỗi vào 1 ống nghỉ, sau đó để ổng nghỉ ở tƣ thế thẳng đứng với đầu ống có lƣới hƣớng lên trên trong thời gian 1 giờ; nếu muỗi không đủ tiêu chuẩn thì loại bỏ và bổ sung đủ số lƣợng.
+ Bƣớc 4: Chuẩn bị ống tiếp xúc
Ống đối chứng: cuộn tờ giấy đối chứng cuốn thành hình trụ lồng vào ống chấm, dùng vòng kim loại giữ cho tờ giấy ép sát vào thành ống.
Ống thử nghiệm: cho giấy tẩm hóa chất vào ống chấm đỏ tƣơng tự nhƣ giấy đối chứng.
+ Bƣớc 5: Chuyển muỗi từ ống nghỉ sang ống tiếp xúc
Lắp ống tiếp xúc vào tấm đế đã gắn ống nghỉ. Dịch chuyển tấm đế đến vị trí mà hai ống tiếp xúc hoàn toàn thông với nhau qua lỗ tròn rồi thổi muỗi sang ống tiếp xúc. Đóng tấm đẩy lại, tháo ống nghỉ ra và đặt sang một bên.
+ Bƣớc 6: Muỗi tiếp xúc với giấy tẩm hóa chất
Để các ống tiếp xúc dựng đứng, phía có lƣới hƣớng lên trên trong thời gian tiếp xúc 60 phút, theo dõi và đếm số muỗi gục ngã trong thời gian tiếp xúc (10 phút, 15 phút, 20 phút, 30 phút, 40 phút, 50 phút và 60 phút).
+ Bƣớc 7: Chuyển muỗi từ ống tiếp xúc sang ống nghỉ
Tiến hành các thao tác ngƣợc lại bƣớc 5. Khi có muỗi ngã gục do tiếp xúc hóa chất, ống tiếp xúc sẽ đƣợc đặt nằm ngang và gõ nhẹ để muỗi tách ra khỏi tấm đẩy trƣớc khi kéo tấm đẩy để tránh muỗi bị kẹt. Lắp ống nghỉ, mở tấm
đẩy giữa và nhẹ nhàng thổi muỗi sang ống nghỉ, đóng tấm đậy lại và tháo ống tiếp xúc ra. Sau đó đặt ống nghỉ dựng đứng và đặt 1 tấm bông có tẩm nƣớc đƣờng glucose 10% lên trên mặt lƣới. Có thể dùng ly nhựa hoặc các dụng cụ thích hợp thay cho ống nghỉ.
+ Bƣớc 8: Muỗi nghỉ sau tiếp xúc
Giữ ống nghỉ trong 24 giờ ở nơi tách biệt, nhiệt độ không quá 300C, theo dõi nhiệt độ và ẩm độ trong suốt quá trình thử nghiệm. Nếu khí hậu hanh khô dùng khăn tẩm nƣớc sạch hoặc khăn ƣớt phủ lên ống nghỉ. Chú ý, không để kiến vào ăn muỗi.
+ Bƣớc 9: Đọc kết quả thử nghiệm
Sau 24 giờ, tính số muỗi chết các lô thử nghiệm. Cá thể nào không bay đƣợc thì coi là muỗi chết dù chân, cánh, pal, vòi vẫn cử động. Kết quả thử nghiệm đƣợc ghi vào phiếu.
+ Bƣớc 10: Vệ sinh dụng cụ
Rửa sạch các dụng cụ thí nghiệm bằng nƣớc với xà phòng, để khô.
Chú ý: các dụng cụ của mẫu thử nghiệm và các dụng cụ mẫu đối chứng phải đƣợc vệ sinh riêng.
* Phiên giải kết quả thử nghiệm
+ Nếu tỷ lệ muỗi chết ở lô đối chứng > 20% thì kết quả thử nghiệm không đƣợc chấp nhận. Cần phải tiến hành lại thử nghiệm.
+ Nếu tỷ lệ muỗi chết ở lô đối chứng < 5%, giữ nguyên tỷ lệ chết của lô tiếp xúc với hóa chất.
+ Nếu tỷ lệ muỗi chết ở lô đối chứng 5- 20% thì tỷ lệ muỗi chết ở lô thử nghiệm đƣợc điều chỉnh theo công thức Abbott:
(Công thức trên đƣợc hiểu là:
Ghi chú: TL: tỉ lệ, TN: thử nghiệm, ĐC: đối chứng)
Trƣờng hợp thử nghiệm với quy mô lớn và trong điều kiện công nghệ thông tin hiện nay, chúng ta có thể áp dụng công thức tổng quát sau:
∑ (
)
Trong đó:
MC(%) : tỉ lệ muỗi chết ở lô thử nghiệm
i : tên của lô thử nghiệm và lô đối chứng tƣơng ứng và i = 1, 2, 3, ... , n. n : tổng số lô thử nghiệm cũng nhƣ số lô đối chứng
Xi: số muỗi chết ở lô thử nghiệm i
Ki: hệ số/tỉ lệ giữa số muỗi trong lô thử nghiệm i và số muỗi trong lô đối chứng i tƣơng ứng (có thể sắp xếp các thử nghiệm phù hợp để Ki là hằng số)
Yi : số muỗi chết trong lô đối chứng i TSMi : số muỗi trong lô thử nghiệm i * Đánh giá kết quả thử nghiệm
Sau 24 giờ, căn cứ trên tỷ lệ muỗi chết để đánh giá mức độ nhạy, kháng của muỗi với hóa chất theo các chỉ số sau:
+ Tỷ lệ muỗi chết ≥ 98%: muỗi nhạy cảm với hóa chất thử nghiệm. + Tỷ lệ muỗi chết 90 97%: muỗi có thể kháng với hóa chất thử nghiệm, cần thử nghiệm thêm 2 lần để khẳng định. Nếu tỷ lệ chết vẫn từ 90
97% thì kết luận muỗi kháng với hóa chất thử nghiệm.
2.4.5. Đánh giá hiệu lực diệt muỗi Ae. aegypti của hóa chất diệt côn trùng
Thực hiện theo Quy trình hƣớng dẫn thử hiệu lực diệt muỗi Aedes của hóa chất diệt côn trùng của Bộ Y tế năm 2013 [3]:
- Trang thiết bị vật tƣ thử nghiệm:
+ Lồng muỗi (20 cm x 20cm) có phủ vải tuyn với mắt lƣới 36 lỗ/cm2±1 + Số lƣợng: 45 lồng (gồm 20 lồng thử nghiệm và 05 lồng đối chứng). + Máy phun, nhiệt kế, ẩm kế, ống nghiệm, đồng hồ hẹn giờ.
+ Trang bị dụng cụ bảo hộ cho ngƣời phun hóa chất. - Điều kiện thử nghiệm:
+ Muỗi Ae. aegypti cái, 2 - 5 ngày tuổi nuôi từ bọ gậy bắt ở thực địa (F0) hoặc thế hệ F1 của chúng bắt ở thực địa. Chọn muỗi cái thử thử nghiệm khỏe mạnh, cơ thể nguyên vẹn, chƣa hút máu và chỉ cho hút đƣờng glucose 10% trƣớc khi thử nghiệm.
+ Nhiệt độ 27 ± 20C và ẩm độ 80 ± 10%. + Thời gian thử nghiệm: từ 6 - 8 giờ sáng.
+ Nhà thử nghiệm: Chọn ngẫu nhiên 05 nhà trong cộng đồng để thử nghiệm với diện tích 20 m2 (khoảng 50 m3). Đồng thời chọn 01 nhà đối chứng có điều kiện tƣơng đồng và đặt lồng ở các vị trí giống với các nhà thử nghiệm.
* Quy trình thử nghiệm
- Chuẩn bị 20 lồng chứa muỗi thử nghiệm, 05 lồng chứa muỗi đối chứng và mỗi lồng có 20 cá thể muỗi. Mỗi nhà thử nghiệm đƣợc treo trong nhà 04 lồng hình trụ kích thƣớc 20cm x 20cm ở các độ cao 0,5m, 1m, 1,5m và 1,8m tính từ mặt đất và đặt lồng đối chứng ở nhà không có hóa chất.
- Pha hóa chất theo các tỷ lệ thử nghiệm với dung môi là nƣớc sạch (phun ULV) và dầu diesel (phun mù nóng).
- Tiến hành sử dụng máy phun phun theo thời gian định trƣớc.
- Sau 60 phút tiếp xúc muỗi trong các lồng thử nghiệm đƣợc chuyển sang các lồng sạch đã chuẩn bị trƣớc và cho hút dung dịch đƣờng glucose 10% và đặt trong phòng có nhiệt độ từ 27 ± 20
C, ẩm độ 80 ± 10%, không có hóa chất, để muỗi nghỉ nghơi và theo dõi trong thời gian 24 giờ.
- Sau 24 giờ, đếm số muỗi chết. Tỷ lệ muỗi chết sau 24 giờ đƣợc dùng để đánh giá hiệu lực diệt của hóa chất thử nghiệm.
* Phiên giải kết quả thử nghiệm
- Ở lô đối chứng có tỷ lệ muỗi chết < 5%: giữ nguyên tỷ lệ chết của lô tiếp xúc với hóa chất.
- Ở lô đối chứng có tỷ lệ muỗi chết > 20% thì hủy bỏ thử nghiệm và làm lại thử nghiệm.
- Nếu lô đối chứng có tỷ lệ muỗi chết 5 - 20% thì tỷ lệ muỗi chết trong thử nghiệm điều chỉnh theo công thức Abbott:
% muỗi chết thí nghiệm – % muỗi chết đối chứng
Tỷ lệ muỗi chết =
100 – % muỗi chết đối chứng * Đánh giá kết quả thử nghiệm:
Sau 24 giờ, đếm số muỗi chết. Tỷ lệ muỗi chết sau 24 giờ đƣợc dùng để