Tiến hành thử nhạy cảm để phát hiện các cá thể còn nhạy, có khả năng kháng hay đã kháng với hóa chất trong quần thể muỗi Ae. aegypti. Thực hiện theo quy trình thử nhạy cảm của WHO năm 2016 [54].
Bảng 2.1. Các hóa chất diệt côn trùng, nồng độ và thời gian thử nghiệm Nhóm hóa chất Tên hóa chất Nồng độ Thời gian
Phốt pho hữu cơ Malathion 5% 1 giờ
Pyrethroid Permethrin Deltamethrin Lambda-cyhalothrin Alphacypermethrin 0,75% 0,05% 0,05% 30mg/m2 1 giờ 1 giờ 1 giờ 1 giờ
- Các loại giấy thử nhạy cảm: Giấy thử tẩm hóa chất diệt côn trùng và giấy đối chứng tẩm dầu do WHO cung cấp đƣợc dùng thử nghiệm (Bảng 2.1).
- Trang thiết bị vật tƣ thử nghiệm:
+ 12 ống nhựa cứng, trong suốt, hình trụ dài 125mm, đƣờng kính 44mm, một đầu ống lắp vào nắp đậy có lƣới nhựa, đầu kia lắp vào tấm đế.
Ống có chấm đỏ: 4 ống, dùng làm ống tiếp xúc.
Ống có chấm xanh: 8 ống, trong đó, có 2 ống dùng làm ống đối chứng.
Tấm đế: 6 tấm (để gắn ống nghỉ với ống tiếp xúc và ống đối chứng). + Giấy nghỉ: 6 tờ (giấy sạch, kích thƣớc 12cm x 15cm)
+ Vòng kim loại: 12 chiếc dùng để giữ cố định giấy thử và giấy nghỉ trong các ống. Gồm 6 vòng bằng thép (dùng cho giấy nghỉ) và 6 vòng bằng đồng (dùng cho giấy thử).
+ Ống hút bằng thủy tinh: 2 cái (dùng để mắt muỗi).
+ Ngoài ra còn cần một số dụng cụ khác nhƣ tube bắt muỗi, khay đựng, bông thấm nƣớc, bông không thấm nƣớc, panh, đồng hồ bấm giờ.
- Điều kiện thử nghiệm:
+ Phòng thử nghiệm phải đảm bảo không tồn dƣ hóa chất. + Nhiệt độ phòng thử từ 250C ± 20C, độ ẩm 80-90%.
+ Muỗi thử nghiệm là muỗi cái Ae. aegypti từ 2-5 ngày tuổi, chƣa hút máu, đã hút đƣờng glucose 10%, khỏe mạnh, cơ thể còn nguyên vẹn. Nếu không đủ số lƣợng thì có thể nuôi và sử dụng thế hệ F1 để thử nghiệm.
+ Mỗi loại hóa chất cần 150 cá thể muỗi cái trƣởng thành khỏe mạnh để thử nghiệm. Trong đó, có 100 muỗi cho tiếp xúc với giấy tẩm hóa chất và 50 muỗi cho tiếp xúc với giấy đối chứng.
* Quy trình thử nghiệm + Bƣớc 1: Chuẩn bị ống nghỉ
Lấy giấy nghỉ ghi số thứ tự của ống thử, tên hóa chất, nồng độ, ngày thử, sau đó cuộn thành hình trụ và lồng vào trong ống nghỉ, dùng vòng để giữ cho tờ giấy ép sát vào thành ống. Lắp ống nghỉ vào tấm đế.
+ Bƣớc 2: Chuẩn bị muỗi thử
Chọn muỗi đủ tiêu chuẩn để thử nghiệm rồi sử dụng tube bắt muỗi trong các lồng muỗi cho vào ống nghỉ, mỗi ống 20 cá thể.
+ Bƣớc 3: Cho muỗi nghỉ
Thả 25 con muỗi vào 1 ống nghỉ, sau đó để ổng nghỉ ở tƣ thế thẳng đứng với đầu ống có lƣới hƣớng lên trên trong thời gian 1 giờ; nếu muỗi không đủ tiêu chuẩn thì loại bỏ và bổ sung đủ số lƣợng.
+ Bƣớc 4: Chuẩn bị ống tiếp xúc
Ống đối chứng: cuộn tờ giấy đối chứng cuốn thành hình trụ lồng vào ống chấm, dùng vòng kim loại giữ cho tờ giấy ép sát vào thành ống.
Ống thử nghiệm: cho giấy tẩm hóa chất vào ống chấm đỏ tƣơng tự nhƣ giấy đối chứng.
+ Bƣớc 5: Chuyển muỗi từ ống nghỉ sang ống tiếp xúc
Lắp ống tiếp xúc vào tấm đế đã gắn ống nghỉ. Dịch chuyển tấm đế đến vị trí mà hai ống tiếp xúc hoàn toàn thông với nhau qua lỗ tròn rồi thổi muỗi sang ống tiếp xúc. Đóng tấm đẩy lại, tháo ống nghỉ ra và đặt sang một bên.
+ Bƣớc 6: Muỗi tiếp xúc với giấy tẩm hóa chất
Để các ống tiếp xúc dựng đứng, phía có lƣới hƣớng lên trên trong thời gian tiếp xúc 60 phút, theo dõi và đếm số muỗi gục ngã trong thời gian tiếp xúc (10 phút, 15 phút, 20 phút, 30 phút, 40 phút, 50 phút và 60 phút).
+ Bƣớc 7: Chuyển muỗi từ ống tiếp xúc sang ống nghỉ
Tiến hành các thao tác ngƣợc lại bƣớc 5. Khi có muỗi ngã gục do tiếp xúc hóa chất, ống tiếp xúc sẽ đƣợc đặt nằm ngang và gõ nhẹ để muỗi tách ra khỏi tấm đẩy trƣớc khi kéo tấm đẩy để tránh muỗi bị kẹt. Lắp ống nghỉ, mở tấm
đẩy giữa và nhẹ nhàng thổi muỗi sang ống nghỉ, đóng tấm đậy lại và tháo ống tiếp xúc ra. Sau đó đặt ống nghỉ dựng đứng và đặt 1 tấm bông có tẩm nƣớc đƣờng glucose 10% lên trên mặt lƣới. Có thể dùng ly nhựa hoặc các dụng cụ thích hợp thay cho ống nghỉ.
+ Bƣớc 8: Muỗi nghỉ sau tiếp xúc
Giữ ống nghỉ trong 24 giờ ở nơi tách biệt, nhiệt độ không quá 300C, theo dõi nhiệt độ và ẩm độ trong suốt quá trình thử nghiệm. Nếu khí hậu hanh khô dùng khăn tẩm nƣớc sạch hoặc khăn ƣớt phủ lên ống nghỉ. Chú ý, không để kiến vào ăn muỗi.
+ Bƣớc 9: Đọc kết quả thử nghiệm
Sau 24 giờ, tính số muỗi chết các lô thử nghiệm. Cá thể nào không bay đƣợc thì coi là muỗi chết dù chân, cánh, pal, vòi vẫn cử động. Kết quả thử nghiệm đƣợc ghi vào phiếu.
+ Bƣớc 10: Vệ sinh dụng cụ
Rửa sạch các dụng cụ thí nghiệm bằng nƣớc với xà phòng, để khô.
Chú ý: các dụng cụ của mẫu thử nghiệm và các dụng cụ mẫu đối chứng phải đƣợc vệ sinh riêng.
* Phiên giải kết quả thử nghiệm
+ Nếu tỷ lệ muỗi chết ở lô đối chứng > 20% thì kết quả thử nghiệm không đƣợc chấp nhận. Cần phải tiến hành lại thử nghiệm.
+ Nếu tỷ lệ muỗi chết ở lô đối chứng < 5%, giữ nguyên tỷ lệ chết của lô tiếp xúc với hóa chất.
+ Nếu tỷ lệ muỗi chết ở lô đối chứng 5- 20% thì tỷ lệ muỗi chết ở lô thử nghiệm đƣợc điều chỉnh theo công thức Abbott:
(Công thức trên đƣợc hiểu là:
Ghi chú: TL: tỉ lệ, TN: thử nghiệm, ĐC: đối chứng)
Trƣờng hợp thử nghiệm với quy mô lớn và trong điều kiện công nghệ thông tin hiện nay, chúng ta có thể áp dụng công thức tổng quát sau:
∑ (
)
Trong đó:
MC(%) : tỉ lệ muỗi chết ở lô thử nghiệm
i : tên của lô thử nghiệm và lô đối chứng tƣơng ứng và i = 1, 2, 3, ... , n. n : tổng số lô thử nghiệm cũng nhƣ số lô đối chứng
Xi: số muỗi chết ở lô thử nghiệm i
Ki: hệ số/tỉ lệ giữa số muỗi trong lô thử nghiệm i và số muỗi trong lô đối chứng i tƣơng ứng (có thể sắp xếp các thử nghiệm phù hợp để Ki là hằng số)
Yi : số muỗi chết trong lô đối chứng i TSMi : số muỗi trong lô thử nghiệm i * Đánh giá kết quả thử nghiệm
Sau 24 giờ, căn cứ trên tỷ lệ muỗi chết để đánh giá mức độ nhạy, kháng của muỗi với hóa chất theo các chỉ số sau:
+ Tỷ lệ muỗi chết ≥ 98%: muỗi nhạy cảm với hóa chất thử nghiệm. + Tỷ lệ muỗi chết 90 97%: muỗi có thể kháng với hóa chất thử nghiệm, cần thử nghiệm thêm 2 lần để khẳng định. Nếu tỷ lệ chết vẫn từ 90
97% thì kết luận muỗi kháng với hóa chất thử nghiệm.