5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1.2.3. Benzamidine ba càng chứa hợp phần α-aminoacid và phức chất
chúng
Năm 1996, L. Beyer và các cộng sự là những người đầu tiên công bố nghiên cứu về benzamidine ba càng chứa hợp phần α-amino acid, họ đã xác định được cấu trúc, độ dài liên kết, góc liên kết của 4 phối tử benzamidine ba càng chứa hợp phần Methyl L-vanalinate và Methyl L-leucine [14]. Các phối tử này được tổng hợp từ phản ứng giữa benzamidoyl chloride với alkylester của α-amino acid dưới sự hỗ trợ của triethylamine theo mô tả ở Hình 1.30.
Hình 1.30. Sơ đồ phản ứng điều chế các benzamidine ba càng chứa hợp phần Methyl L-vanalinate và Methyl L-leucine
Hình 1.31 trình bày cấu trúc của bốn phối tử benzamidine ba càng chứa hợp phần Methyl L-vanalinate và Methyl L-leucine được L. Beyer xác định bằng nhiễu xạ đơn tinh thể.
Hình 1.31. Cấu trúc 4 benzamidine ba càng chứa hợp phần Methyl L-vanalinate và Methyl L-leucine [14]
Trong 4 cấu trúc ở Hình 1.31, các phối tử (3v), (3v’) và (3l) có điểm chung là nguyên tử N1 không liên kết với H, nó ở dạng enamine.
Một số độ dài liên kết, góc liên kết của bốn phối tử (3v), (3v’), (3l) và (4) được trình bày ở Bảng 1.7.
Bảng 1.7. Một số độ dài liên kết, góc liên kết trong 4 phối tử benzamidine ba càng chứa hợp phần Methyl L-vanalinate và Methyl L-leucine [14]
Năm 2009, U. Abram và cộng sự công bố nghiên cứu về cấu trúc của phức chất của oxorhenium(V) với phối tử benzamidine ba càng chứa hợp phần glycine ethylester [52]. Cấu trúc của phối tử này được đưa ra ở Hình 1.32.
Hình 1.32. Cấu trúc của phối tử benzamidine ba càng chứa hợp phần glycine ethylester (HL(GlyOEt)) [52]
Phức chất của phối tử benzamidine ba càng chứa hợp phần glycine ethylester với ion kim loại Re(V)[52] đã được nghiên cứu bằng nhiễu xạ đơn tinh thể (Hình 1.33). Nghiên cứu đã chỉ ra benzamidine chứa hợp phần glycine ethylester đóng vai trò phối tử benzamidine một càng thông qua nguyên tử cho S hoặc ba càng thông qua bộ nguyên tử cho (S,N,O) khi nhóm ester bị thủy phân.
Năm 1999, J. J. Criado và cộng sự tiến hành nghiên cứu về hoạt tính kháng nấm của phức chất benzamidine ba càng chứa dẫn xuất vaniline và leucine với các ion kim loại Ni(II), Cu(II), Pt(II) trên dòng nấm Botrytis cinerea (gây bệnh thối xám), nấm Colletotrichum fragariae (gây bệnh thán thư), nấm Rhizoctonia solani (gây bệnh thối rễ), nấm Pleospora betae (gây bệnh thối lá). Kết quả đạt được cho thấy cả phối tử và phức chất của chúng đều có hoạt tính cao [18], [49].
Từ tổng quan đã nêu ở trên, có thể thấy hướng nghiên cứu về hóa học phối trí của (N,N-dialkylthiourea)benzamidine ba càng chứa hợp phần α- amino acid là một hướng nghiên cứu mới với phạm vi nghiên cứu rộng và tiềm năng ứng dụng lớn. Tuy nhiên, hiện vẫn còn đang ở thời kỳ sơ khai. Việc tổng hợp, khảo sát phối tử và phức chất còn thiếu tính hệ thống. Cụ thể, chỉ có một số ít phối tử (N,N-dialkylthiourea)benzamidine ba càng chứa hợp phần α- amino acid và phức chất của chúng với Ni(II), Cu(II), Pt(II), Re(V) được khảo sát nhưng chỉ có vài cấu trúc được làm sáng tỏ bằng các phương pháp hiện đại như nhiễu xạ tia X trên đơn tinh thể. Hoạt tính sinh học tiềm năng của lớp hợp chất này chưa được quan tâm đúng mức. Hiện chỉ có 6 phức chất của Ni(II), Cu(II), Pt(II) được được khảo sát hoạt tính kháng nấm, còn các hoạt tính khác như kháng khuẩn, kháng virut, kháng tế bào ung thư… chưa được thực hiện. Những nghiên cứu nhỏ lẻ trên một vài phức chất gây hạn chế việc làm rõ mối liên hệ giữa hoạt tính sinh học và cấu trúc.
Do vậy yêu cầu đặt ra là cần nghiên cứu một cách có hệ thống cấu trúc
các phức chất của (N,N-dialkylthiourea)benzamidine ba càng chứa hợp phần α-amino acid với các ion kim loại chuyển tiếp bằng phương pháp nhiễu xạ tia
X đơn tinh thể, tiếp theo là khảo sát các hoạt tính sinh học như kháng nấm, kháng khuẩn, kháng virut, kháng tế bào ung thư, qua đó làm sáng tỏ mối liên hệ giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học. Với những bài toán đặt ra ở trên,
hướng đề tài “Nghiên cứu tổng hợp và xác định cấu trúc các phức chất của phối tử (N,N-dialkylthiourea)benzamidine ba càng chứa hợp phần glycine với các ion Co2+ và Ni2+”là cần thiết, có ý nghĩa về mặt khoa học và thực tiễn.
CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 2.1. Giới thiệu về các phương pháp nghiên cứu
2.1.1. Phân tích hàm lượng ion kim loại bằng chuẩn độ complexon III
Hàm lượng ion M2+ (Co2+, Ni2+) được xác định dựa trên phản ứng tạo phức bền của ion kim loại với EDTA tại pH = 8, chất chỉ thị là murexit 1% trong NaCl.
M2+ + H2Y2- → MY2- + 2H+ MH4Ind+ + H2Y2- → MY2- + H4Ind-
(vàng nhạt) (tím)
Cách tiến hành: Lấy chính xác V1 (ml) dung dịch mẫu vào bình nón, thêm một ít chỉ thị murexit, dùng dung dịch NH3 để điều chỉnh pH 8 (thêm vài giọt dung dịch NH3 cho tới khi trong bình có màu vàng thoáng đục). Chuẩn độ M2+ bằng dung dịch EDTA đã biết nồng độ cho tới khi dung dịch chuyển sang màu tím.Lặp lại thí nghiệm ba lần và lấy kết quả trung bình V2
(ml) lượng EDTA đã chuẩn độ.
Hàm lượng ion M2+ được tính theo công thức sau:
trong đó:
V1 : thể tích dung dịch M2+ đem chuẩn độ (ml) V2 : thể tích dung dịch EDTA đã tiêu tốn (ml)
CEDTA : nồng độ mol của dung dịch EDTA đã dùng (mol/l) MM : khối lượng mol của kim loại M (g/mol)
2.1.2. Phương pháp phổ hồng ngoại IR
Theo vật lý lượng tử, một phân tử có ba dạng chuyển động cơ bản là: chuyển động của các electron, chuyển động dao động và chuyển động quay của các nguyên tử và nhóm nguyên tử [3], [5]. Để thực hiện các chuyển mức dao động, phân tử phải hấp thụ những bức xạ trong vùng hồng ngoại.
Khi bị chiếu bởi một chùm bức xạ hồng ngoại đa sắc, vật chất thường hấp thụ một phần của vùng sóng này, dẫn đến cường độ chùm tia đi ra I thường nhỏ hơn chùm tia tới Io. Tỷ số I/Io gọi là độ hấp thụ ánh sáng, nếu vẽ đường biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ ánh sáng vào một đại lượng đặc trưng cho bản chất ánh sáng, chẳng hạn số sóng ν (cm-1), sẽ thu được một đường cong phức tạp, với những cực đại và cực tiểu. Đường cong này gọi là phổ hấp thụ hồng ngoại của chất nghiên cứu [3].
Những quan sát phổ thực nghiệm của một lượng lớn các hợp chất chứa cùng một số nhóm nguyên tử giống nhau cho thấy các nhóm này đều thể hiện những dải hấp thụ với tần số gần như giống nhau, từ đó người ta thống kê lại các tần số dao động này để làm tài liệu tra cứu. Bằng cách so sánh phổ thực nghiệm với phổ chuẩn của một hợp chất hay bảng thống kê tần số dao động của các nhóm nguyên tử, ta có thể nhận biết sự có mặt hay không của một nhóm chức nào đó ở chất nghiên cứu.
2.1.3. Phương pháp phổ khối lượng ESI-MS
Nguyên tắc chung của phương pháp phổ khối lượng là phá vỡ phân tử trung hòa thành ion phân tử và các ion mảnh có số khối A = m/z (m là khối lượng, z là điện tích ion), sau đó phân tách những ion này theo số khối. Dựa vào phổ khối lượng có thể xác định phân tử khối và cấu tạo phân tử của chất
bằng nhiều phương pháp khác nhau như: phương pháp va chạm electron (EI: electron ionization), phương pháp ion hóa phun điện tử (ESI: electrospray ionization), phương pháp ion hóa hóa học (CI: chemical ionization) [3].
ESI là phương pháp ion hóa phổ biến dùng cho nghiên cứu phức chất và phù hợp với các hợp chất kém bay hơi. Phương pháp này có đặc điểm là quá trình ion hóa xảy ra êm dịu. Trong kỹ thuật ESI, các ion dương tạo thành có thể gắn thêm một proton và các ion âm tạo thành có thể mất bớt một proton, do vậy ion dương [M + H]+ có khối lượng lớn hơn khối lượng phân tử một đơn vị và ion âm [M – H]- có khối lượng nhỏ hơn khối lượng phân tử một đơn vị [48]. Trong nhiều trường hợp các ion dương được tạo thành do kết hợp với các cation có sẵn trong dung dịch như Na+, K+, NH4+, tạo nên các ion dương [M + Na]+, [M + K]+, [M + NH4]+. Đối với phức chất chứa các phối tử mang điện tích âm linh động như các halogenua X-, ion dương [M – X]+ có thể tạo thành khi các phối tử này bị tách ra khỏi phân tử.
2.1.4. Phương pháp nhiễu xạ tia X đơn tinh thể.
Tinh thể học tia X là ngành khoa học xác định sự sắp xếp của các nguyên tử bên trong tinh thể dựa vào dữ liệu về sự nhiễu xạ tia X khi chiếu vào đơn tinh thể. Vì cấu trúc phân tử đóng vai trò quyết định trong việc hiểu và lý giải các tính chất lý hóa của vật chất nói chung, nên tinh thể học tia X đóng một vai trò nòng cốt trong sự phát triển của nhiều lĩnh vực khoa học. Với tinh thể có độ tinh khiết và đồng đều cao, độ chính xác của phép đo có thể đạt tới 0,0001 Å đối với độ dài liên kết và 0,01o đối với góc liên kết.
Khi chiếu tia X đi qua một đơn tinh thể của chất cần nghiên cứu, tia X bị nhiễu xạ và tách thành nhiều tia X thứ cấp. Nguyên nhân của hiện tượng này là do các nguyên tử bên trong tinh thể có trật tự xác định và phân bố tuần hoàn theo 3 trục tinh thể, tạo ra các mặt phẳng nút có khoảng cách đều nhau và gây nên hiện tượng nhiễu xạ tia X. Hình ảnh của các tia nhiễu xạ là những
vết nhiễu xạ (nốt sáng) có thể ghi lại được khi đặt một detectơ phía sau tinh thể. Hai thông tin thu được từ vết nhiễu xạ là vị trí và cường độ của vết nhiễu xạ.
Quy trình chung của phương pháp nhiễu xạ tia X đơn tinh thể có thể chia làm ba bước chính (Hình 1.34). Đầu tiên là thu thập một tinh thể tốt, có kích thước đủ lớn (thường là lớn hơn 0,1 mm ở mỗi chiều).
Hình 2.1. Quy trình xác định cấu trúc phân tử bằng nhiễu xạ tia X đơn tinh thể
Bước thứ hai là đặt tinh thể vào trong đường đi của chùm tia X song song, đơn sắc. Từ từ xoay tinh thể và ghi lại hình ảnh của các tia nhiễu xạ ở mỗi vị trí của tinh thể. Tùy vào bản chất của tinh thể, số liệu thu được có thể chứa hàng chục ngàn các vết nhiễu xạ với các vị trí và cường độ khác nhau.
trong tinh thể.
Vị trí của các vết nhiễu xạ được giải thích bằng mô hình phản xạ của Bragg, trong đó, ảnh nhiễu xạ là kết quả của sự giao thoa các tia X phản xạ trên các họ mặt phẳng nút hkl. Mối liên hệ giữa vị trí của các vết nhiễu xạ và cấu trúc tinh thể, hay cụ thể là các thông số mạng của tinh thể được thể hiện qua phương trình Bragg: 2dhkl.sinθ = λ, trong đó dhkl là khoảng cách giữa hai mặt liên tiếp trong họ mặt phẳng hkl, θ là góc phản xạ Bragg và λ là bước sóng của tia X [5].
Cường độ của vết nhiễu xạ từ họ mặt phẳng hkl được biểu diễn thông qua thừa số cấu trúc F(hkl) và tỷ lệ thuận với bình phương biên độ hàm sóng tổ hợp từ các sóng nhiễu xạ tại các nguyên tử trong ô mạng cơ sở. Trong trường hợp tổng quát, nếu có N nguyên tử trong ô mạng cơ sở, nguyên tử thứ j chiếm vị trí (xj, yj, zj).
Thừa số cấu trúc và biên độ hàm sóng tổ hợp được tính theo công thức:
2 2 F(hkl) = A(hkl) +B(hkl) với N j j j j j=1
A(hkl) =f .cos2π(hx +ky +lz ) và
N
j j j j
j=1
B(hkl) =f .sin2π(hx +ky +lz ) Trong đó fj là thừa số nhiễu xạ nguyên tử có giá trị phụ thuộc vào số electron xung quanh hạt nhân hay nói cách khác phụ thuộc vào điện tích hạt nhân. Các nguyên tố khác nhau sẽ có thừa số fj khác nhau.
Như vậy, nếu ta biết được bản chất của từng nguyên tử (loại nguyên tử C, N hay Fe...) và vị trí của chúng trong ô mạng cơ sở (xj, yj, zj), ta sẽ tính toán được giá trị (lí thuyết) thừa số cấu trúc F(hkl)c của mọi vết nhiễu xạ. Cấu trúc phân tử của một chất chính là “mô hình” cho các giá trị F(hkl) tính toán c phù hợp nhất với các giá trị F(hkl)oxác định bằng thực nghiệm. Giá trị
o
F(hkl) tỷ lệ với căn bậc hai của cường độ ảnh nhiễu xạ đo được trên detector. Các phương pháp thống kê thường được dùng để đánh giá độ sai lệch giữa cấu trúc tính toán lí thuyết với số liệu thực nghiệm. Độ sai lệch R1 được tính bằng công thức : o c hkl 1 o hkl F - F R = F
Trong đó: Fo là cường độ vết nhiễu xạ thực nghiệm Fc là cường độ vết nhiễu xạ tính từ cấu trúc
Đối với các phân tử dưới 100 nguyên tử, giá trị độ sai lệch R1 được chấp nhận trong khoảng dưới 10%.
2.1.5. Phương pháp xác định tính độc tế bào ung thư (cytotoxic assay)
Phương pháp thử độ độc tế bào ung thư in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute - NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro. Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Monks (1991). Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD - Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:
- Cho chất thử đã pha ở các nồng độ vào các giếng của đĩa 96 giếng, thêm tế bào đã điều chỉnh nồng độ phù hợp ở trên vào các giếng này sao cho nồng độ chất thử trong giếng là 100 g/ml; 20 g/ml; 4 g/ml và 0,8 g/ml . Ủ trong tủ ấm 48 giờ. Giếng không có chất thử nhưng có tế bào ung thư (180l) sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, giếng đối chứng ngày 0 tế bào sẽ được cố định bằng Trichloracetic acid – TCA.
- Sau 48 giờ, tế bào được cố định bằng TCA trong 1 giờ, được nhuộm bằng SRB trong 30 phút ở 37 oC, rửa 3 lần bằng acetic acid rồi để khô ở nhiệt độ phòng.
- Sử dụng dung dịch tris(hydroxymethyl)aminomethane 10 mM để hòa tan lượng SRB đã bám và nhuộm các phân tử protein, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút.
- Đọc kết quả OD ở bước sóng 515 nm trên máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad).
Phần trăm ức chế sự phát triển của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau:
- Phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác.
- Ellipticine ở các nồng độ 10 g/ml; 2 g/ml; 0,4 g/ml; 0,08 g/ml được sử dụng như là chất đối chứng dương.
- DMSO 10% được sử dụng là đối chứng âm.
- Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4.
- Theo tiêu chuẩn của Viện ung thư quốc gia Hoa Kỳ (NCI), cặn chiết được coi có hoạt tính tốt với IC50 20 μg/ml, trong khi chất tinh khiết được coi có hoạt tính tốt khi IC50 5 μM [34].
2.2. Các kỹ thuật kết tinh phức chất
Các kỹ thuật thường được sử dụng để kết tinh lại phức chất bao gồm bay hơi dung môi, làm lạnh chậm dung dịch, khuếch tán dung môi, khuếch tán hơi, thăng hoa... Tùy vào đặc tính của phức chất mà lựa chọn phương pháp kết tinh phù hợp [33].
2.2.1. Phương pháp bay hơi dung môi
Đây là kỹ thuật đơn giản nhất, thường áp dụng cho các chất bền, cấu trúc ổn định trong không khí. Chọn dung môi hoặc hỗn hợp dung môi thích hợp để hòa tan phức chất đến dung dịch gần bão hòa. Cho dung dịch phức chất vào lọ