5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
2.2.2. Khuếch tán dung môi
Phương pháp này thường áp dụng cho lượng phức chất ít (cỡ mg) và các mẫu nhạy cảm với không khí hoặc dung môi. Một dung dịch được đặt trong ống mẫu sau đó dung môi khó hòa tan thứ hai được nhỏ giọt cẩn thận xuống bên cạnh ống bằng pipet hoặc ống tiêm để tạo thành một lớp phủ kín phía trên. Hệ dung môi thường được sử dụng phổ biến là là CH2Cl2/EtOH và ether, với điều kiện mẫu gần như không hòa tan trong ether. Các tinh thể hình thành tại ranh giới nơi các dung môi từ từ khuếch tán vào nhau.
Chuẩn bị dung dịch bão hòa trong đó dung môi được đun nóng đến ngay dưới điểm sôi. Chuyển dung dịch vào ống có nắp và đặt ống này vào bình ổn nhiệt chứa nước ở nhiệt độ ngay dưới điểm sôi của dung môi. Mực nước phải vượt quá mức dung môi. Trong vài ngày, tinh thể có thể được tạo thành khi nhiệt độ hạ xuống từ từ.
2.2.4. Khuếch tán hơi
Phương pháp này thường được áp dụng cho trường hợp lượng mẫu ít (cỡ mg). Dung dịch mẫu chứa trong ống mẫu nhỏ được đặt trong ống lớn hơn chứa dung môi hòa tan kém phức chất hơn và ống này sau đó được đậy kín. Phương pháp này có hiệu quả nhất nếu dung môi của dung dịch chứa phức chất ít bay hơi và dung môi ngoài là dung môi khuếch tán mạnh hơn vào dung dịch mẫu.
2.2.5. Thăng hoa trong chân không
Một lượng lớn các chất có thể có thể áp phương pháp này để thu được đơn tinh thể có chất lượng tốt. Chân không sử dụng có thể là tĩnh hoặc động. Một lượng nhỏ mẫu được cho vào ống Pyrex, bịt kín, hút chân không và gia nhiệt từ từ theo chương trình. Chất sẽ thăng hoa và kết tinh trên đế. Sự thăng hoa chân không là lý tưởng cho các hợp chất nhạy cảm với không khí.
2.3. Thực nghiệm
2.3.1. Dụng cụ
Bình cầu hai cổ (50 ml, 500 ml, 750 ml), bình cầu một cổ 50 ml, phễu nhỏ giọt (100 ml), công tơ hút nhựa, nút nhám các loại, nhiệt kế 150oC, sinh hàn, bẫy dầu, đũa thủy tinh, máy khuấy từ gia nhiệt, con khuấy từ, cân phân tích, phễu lọc thủy tinh đáy xốp, cốc chịu nhiệt (500 ml), máy lọc hút chân không, bình hút ẩm, bếp điện, hệ thống cất quay làm khô dung môi, tủ sấy, tủ hốt.
2.3.2. Hóa chất
- Dung môi: nước cất, CH3OH, C2H5OH, (CH3)2CO, CCl4, CHCl3, CH2Cl2, THF, C6H5CH3.
- Hóa chất dùng phá mẫu: HNO3 65%, H2O2 30%. - Hóa chất sử dụng trong tổng hợp:
Hóa chất Xuất xứ Độ tinh khiết
C6H5CO-Cl Sigma-Aldrich 99% Co(OAc)2.4H2O Sigma-Aldrich 99% Ni(OAc)2.4H2O Sigma-Aldrich 99% (C2H5)2NH Sigma-Aldrich 99% (C2H5)3N Sigma-Aldrich 99% SOCl2 Sigma-Aldrich 97% KSCN Sigma-Aldrich 99%
Glycine methyl ester hydrochloride Sigma-Aldrich 99%
2.3.3. Chuẩn bị hóa chất
- KSCN được sấy khô trong tủ sấy ở 80 oC cho đến khi khối lượng không đổi.
- Các dung môi dùng cho phản ứng được chưng cất lại, sau đó làm khô trong hệ thống làm khô dung môi. Acetone và carbon tetrachloridche được làm khô bằng P2O5. Trietylamine và THF được làm khô bằng Na, có sử dụng chỉ thị benzophenon (khi đã khan nước, chỉ thị từ không màu sẽ chuyển sang màu xanh).
2.4. Tổng hợp phối tử HG
2.4.1. Giai đoạn 1: Tổng hợp N,N-diethyl-N’-benzoylthiourea
Quá trình tổng hợp N,N-diethyl-N’-benzoylthiourea được thực hiện theo quy trình phản ứng “một bước” (one pot) do I. B. Douglass và F. B. Dains đưa ra năm 1934 [23].
Lắp hệ thống phản ứng gồm bình cầu hai cổ 750 ml, phễu nhỏ giọt 100 ml, khuấy từ, sinh hàn, bẫy dầu, bếp từ gia nhiệt.
Cho 58 ml (~ 0,5 mol) benzoyl chloride (dbenzoyl chloride = 1,21 g/ml) vào phễu nhỏ giọt, cho thêm 20 ml axeton khô, rồi nhỏ từ từ vào bình cầu hai cổ chứa 53 g KSCN sấy khô (~ 0,55 mol) đã hòa tan trong 50 ml axeton khan. Đun nóng và khuấy đều hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ 50 oC trong 2 giờ. Để nguội bình phản ứng về nhiệt độ phòng, sau đó tiếp tục nhỏ từ từ 40 ml diethylamine (C2H5)2NH (~ 0,55 mol) vào bình phản ứng, khuấy đều hỗn hợp phản ứng trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng và tiếp tục khuấy ở nhiệt độ 50 oC trong 2 giờ. Để nguội bình phản ứng về nhiệt độ phòng rồi rót hỗn hợp phản ứng vào cốc chứa 800 ml nước cất, khuấy nhẹ bằng đũa thủy tinh trong 10 phút để N,N-diethyl-N’-benzoylthiourea kết tủa hoàn toàn. Lọc hút chất rắn trên phễu thủy tinh đáy xốp, rồi làm khô sản phẩm trong không khí. Kết quả thu được 90,5 g N,N-diethyl-N’-benzoylthiourea màu trắng, hiệu suất đạt ~ 75%.
2.4.2. Giai đoạn 2: Tổng hợp phức chất bis(N,N-diethyl-N’-benzoylthioureato) nickel(II) benzoylthioureato) nickel(II)
Hòa tan 70 g N,N-diethyl-N’-benzoylthiourea (0,3 mol) bằng ethanol nóng trong cốc chịu nhiệt 500 ml, thêm dần dung dịch chứa 37,33 g muối Ni(OAc)2.4H2O (0,15 mol) trong metanol nóng vào dung dịch trên. Vừa khuấy vừa đun nóng nhẹ trong vòng 15 phút, sau đó để nguội về nhiệt độ phòng. Thấy xuất hiện kết tủa màu đỏ tím. Tiến hành lọc và sấy khô kết tủa,
thu được 75,4 g phức chất bis(N,N-diethyl-N’-benzoylthioureato) nickel(II). Hiệu suất đạt 95%.
2.4.3. Giai đoạn 3: Tổng hợp N,N-(diethylcarbamothioyl)benzimidoyl chloride chloride
Lắp hệ thống phản ứng gồm bình cầu hai cổ 750 ml, phễu nhỏ giọt 100 ml, khuấy từ, sinh hàn, bẫy dầu, bếp từ gia nhiệt.
Hình 2.2. Hệ thống điều chế N,N-(diethylcarbamothioyl)benzimidoyl chloride
Cho 26,4 gam phức chất bis(N,N-diethyl-N’-benzoylthioureato) nickel(II) (0,05 mol) vào bình cầu 2 cổ chứa 100 ml CCl4 khan, tiếp tục nhỏ từ từ 7,5 ml SOCl2 khan vào bình phản ứng. Tiến hành khuấy và đun nóng ở nhiệt độ 50 oC trong 2 giờ. Sau đó nhanh chóng lọc nóng hỗn hợp phản ứng trên phễu lọc khô, thu lấy dịch lọc. Dịch lọc thu được trong suốt và có màu
(diethylcarbamothioyl)benzimidoyl chloride màu vàng nhạt. Bảo quản sản phẩm trong lọ kín. Hiệu suất đạt 52%.
2.4.4. Giai đoạn 4: Tổng hợp phối tử (N,N-diethylthiourea)benzamidine ba càng chứa hợp phần glycine (HG)
Thực hiện phản ứng N,N-(diethylcarbamothioyl)benzimidoyl chloride với Glycine methyl ester hydrochloride với sự hỗ trợ của base (Et)3N theo tài liệu [8] nhưng sử dụng dung môi THF khan thay cho acetone khan.
Lắp hệ phản ứng gồm bình cầu hai cổ dung tích 50 ml, phễu nhỏ giọt, khuấy từ, bẫy dầu.
Hình 2.3. Hệ thống điều chế phối tử HG
Hòa tan 1,54 g Glycine methyl ester hydrochloride (0,01 mol) vào 15 ml THF khan chứa trong bình cầu, tiếp tục cho 2,5 ml trietylamin khan (0,04 mol, lấy dư 100%), khuấy đều, sau đó thêm từ từ 10 ml dung dịch THF khan chứa 2,55 g N,N-(diethylcarbamothioyl)benzimidoyl chloride (0,01 mol). Khuấy hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ 0 oC trong thời gian 30 phút, sau đó khuấy ở nhiệt độ phòng trong 3 giờ. Lọc bỏ kết tủa, thu lấy dịch lọc. Sau khi loại bỏ dung môi THF ở dịch lọc bằng máy cất quay chân không, hòa tan
phần rắn dạng dầu bằng 5ml chloroform và 2 ml THF. Để yên dịch lọc trong tủ lạnh để phối tử tự kết tinh. Kết quả thu được 2,06 g tinh thể phối tử màu trắng. Hiệu suất đạt ~ 67%.
2.5. Tổng hợp phức chất
2.5.1. Tổng hợp phức chất Co(II)-HG
Chuẩn bị 2 lọ thủy tinh nhỏ, lọ thứ nhất hòa tan hoàn toàn 0,249 g Co(OAc)2.4H2O (1 mmol) bằng 5 ml CH3OH. Lọ thứ hai hòa tan hoàn toàn 0,307 g HG (1 mmol) trong 5 ml CH3OH. Cho dung dịch ở lọ thứ hai vào trong lọ thứ nhất, khuấy đều, hỗn hợp phản ứng chuyển nhanh sang màu tím. Thêm tiếp 4 giọt (Et)3N, sau đó đun nóng nhẹ ở 40 oC và khuấy đều hỗn hợp phản ứng trong 2 giờ. Lọc và thu kết tủa màu tím đen, sau đó sấy khô trong chân không. Hiệu suất phản ứng đạt 70%.
Hiện chưa thu được đơn tinh thể phức chất mặc dù đã thử nhiều phương pháp và thay đổi nhiều hệ dung môi khác nhau. Chưa kết tinh được phức chất Co(II)-HG là do chưa tìm ra điều kiện tối ưu hoặc do phức chất Co(II)-HG là chất linh động.
Bảng 2.1. Sự thay đổi màu sắc trong quá trình tổng hợp phức chất Co(II)-HG
Muối Màu dung
dịch muối Màu dung dịch phối tử Màu hỗn hợp phản ứng Màu phức chất dạng bột Co(OAc)2.4H2O Hồng Không màu Tím Tím đen
2.5.2. Tổng hợp phức chất Ni(II)-HG
Chuẩn bị 2 lọ thủy tinh nhỏ, lọ thứ nhất hòa tan hoàn toàn 0,249 g Ni(OAc)2.4H2O (1 mmol) bằng 5 ml CH3OH. Lọ thứ hai hòa tan hoàn toàn
hợp phản ứng trong 2 giờ. Lọc và thu kết tủa màu nâu đỏ, sau đó sấy khô trong chân không. Hiệu suất phản ứng đạt 70%.
Hiện chưa thu được đơn tinh thể phức chất Ni(II)-HG mặc dù đã thử nhiều phương pháp và thay đổi nhiều hệ dung môi khác nhau. Chưa kết tinh được phức chất Ni(II)-HG là do chưa tìm ra điều kiện tối ưu hoặc do phức chất Ni(II)-HG là chất linh động.
Bảng 2.2. Sự thay đổi màu sắc trong quá trình tổng hợp phức chất Ni(II)-HG
Muối Màu dung
dịch muối Màu dung dịch phối tử Màu hỗn hợp phản ứng Màu phức chất dạng bột Ni(OAc)2.4H2O Xanh nhạt Không màu Xanh lá Nâu đỏ
2.6. Điều kiện thực nghiệm
- Phương pháp chuẩn độ complexon III được thực hiện tại Khoa Khoa học Tự nhiên – Trường Đại học Quy Nhơn.
Chuẩn bị mẫu: Mẫu được sấy khô ở nhiệt độ 80 oC trong chân không đến khối lượng không đổi. Cân chính xác một lượng mẫu đã sấy khô (khoảng 0,5 - 0,7 g), cho vào bình Kendan, tẩm ướt mẫu bằng 3 - 4 giọt nước cất. Thêm ~ 10 ml HNO3 65% và ~ 2 ml H2O2 30%, lắc đều và đun sôi nhẹ để phân hủy mẫu. Khi dung dịch mẫu trong suốt, tiếp tục đun sôi đến gần cạn. Thêm tiếp ~ 2 ml H2O2 và đun sôi đến sền sệt. Lặp lại quá trình thêm H2O2 hai lần để đuổi hết HNO3 và các khí NO, NO2 hòa tan. Để nguội về nhiệt độ phòng, thêm nước cất và chuyển định lượng dung dịch vào bình định mức 50 ml, sau đó thêm nước cất tới vạch mức.
- Phổ hồng ngoại được ghi trên máy IRAffinity-1S trong vùng 400 - 4000 cm-1 tại Bộ môn Hoá Vô cơ, Khoa Hoá học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên - Đại học Quốc Gia (ĐHKHTN-ĐHQG) Hà Nội. Mẫu được ép viên rắn với KBr.
- Phổ khối lượng được đo theo phương pháp ESI, trên máy LQT Orbitrap XL tại Khoa Hóa học, Trường ĐHKHTN-ĐHQG Hà Nội.
- Dữ liệu nhiễu xạ tia X đơn tinh thể được đo trên máy Bruker D8 Quest ở nhiệt độ 100K, đối âm cực Mo, với bước sóng Kα (λ = 0,71073 Å) tại Khoa Hoá học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên - Đại học Quốc Gia Hà Nội. Quá trình xử lí số liệu và hiệu chỉnh sự hấp thụ tia X bởi đơn tinh thể được thực hiện trên các phần mềm chuẩn của máy đo. Cấu trúc được xác định theo phương pháp trực tiếp (direct method). Phần mềm Olex2-1.2 [22] được sử dụng để tính cấu trúc và phần mềm SHELXL2017 [55] được dùng để tối ưu hóa cấu trúc. Vị trí các nguyên tử hydrogen được xác định theo các thông số lí tưởng (góc, độ dài liên kết) bằng phần mềm SHELXL2017. Ảnh nhiễu xạ được ghi trên detector CMOS dạng hình vuông kích thước 20cm x 20cm. Khoảng cách từ tinh thể đến detector là 4 cm. Quá trình xử lí số liệu và hiệu chỉnh sự hấp thụ tia X bởi đơn tinh thể được thực hiện trên các phần mềm chuẩn của máy đo. Cấu trúc được xác định theo phương pháp trực tiếp. Phần mềm Olex 2 được sử dụng để tính cấu trúc và phần mềm SHELXL2014 được dùng để tối ưu hóa cấu trúc. Vị trí các nguyên tử hiđro được xác định theo các thông số lí tưởng (góc, độ dài liên kết) bằng phần mềm SHELXL2014.
- Phương pháp xác định tính độc tế bào ung thư của phối tử HG và hai phức chất Co(II)-HG, Ni(II)-HG được thực hiện tại phòng Hoạt tính Sinh học - Viện Hóa học - Viện Khoa học Việt Nam. Hai dòng tế bào ung thư được sử dụng là (Hepatocellular carcinoma) ung thư gan HepG2 và (Human breast carcinoma) ung thư vú MCF7.
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Thảo luận về quá trình tổng hợp và nghiên cứu phối tử HG
3.1.1. Thảo luận về quá trình tổng hợp HG
Công thức cấu tạo của phối tử HG được dự đoán như Hình 3.1:
Hình 3.1. Công thức cấu tạo dự đoán và quy ước đánh số các nguyên tử của phối tử HG
HG là một phối tử (N,N-diethylthiourea)benzamidine ba càng chứa hợp phần Glycine methyl ester. Tên gọi của nó theo IUPAC là methyl (Z)-(((diethylcarbamothioyl)imino)(phenyl)methyl)glycinate.
Quá trình tổng hợp HG trải qua 4 giai đoạn, bao gồm: - Tổng hợp N,N-diethyl-N’-benzoylthiourea
- Tổng hợp N,N-(diethylcarbamothioyl)benzimidoyl chloride
- Tổng hợp phối tử HG
Quá trình tổng hợp N,N-diethyl-N’-benzoylthiourea được tiến hành trong điều kiện khan, nên KSCN và dung môi acetone phải được làm khô kỹ. Nếu môi trường phản ứng có lẫn nước, chất đầu benzoyl chloride và sản phẩm trung gian benzoyl isothiocyanate (là những chất rất nhạy nước) sẽ bị thủy phân tạo axit C6H5COOH, HCl, HSCN. Các axit này sẽ tác dụng với amine (C2H5)2NH tạo thành muối amoni tương ứng, làm giảm hiệu suất tổng hợp.
Cơ chế của một số phản ứng trên có thể được dự đoán như sau: phản ứng giữa benzoyl chloride với KSCN xảy ra theo cơ chế thế nucleophin lưỡng
chế thế nucleophin nội phân tử SNi và phản ứng giữa
N,N-(diethylcarbamothioyl)benzimidoyl chloride với Glycine methyl ester hydrochloride dưới sự có mặt của Et3N xảy ra theo cơ chế thế nucleophin lưỡng phân tử SN2(CO). Et3N có vai trò thúc đẩy quá trình tách H+.
3.1.2. Nghiên cứu cấu trúc phối tử HG
3.1.2.1. Nghiên cứu phối tử bằng phương pháp IR
Phổ IR của phối tử HG tự do được trình bày ở Hình 3.2. Kết quả quy gán một số dao động hóa trị (cm-1) trên phổ IR của HG được đưa ra ở Bảng 3.1.
Hình 3.2. Phổ IR của phối tử HG
Bảng 3.1. Quy gán một số dao động hóa trị (cm-1) trên phổ IR của HG
N-H ν νC-H νC=O νC=N, νC=C HG 3197 (y) 2976 (y), 2931 (y), 2870 (y) 1749 (rm) 1613 (rm), 1526 (m), 1485 (rm), 1416 (rm) Dải hấp thụ có cường độ yếu ở 3197cm-1 được quy gán cho dao động hóa trị N–H của hợp phần glycine.
Dải hấp thụ rất mạnh ở 1749 cm-1 được quy gán cho dao động hóa trị của nhóm C=O trong hợp phần glycine.
Trên phổ IR của HG không thấy xuất hiện dải hấp thụ ở vùng 2600 - 2550 cm-1, chứng tỏ phối tử ở trạng thái rắn không tồn tại dạng đồng phân tautome chứa nhóm thiol –SH.
Dải hấp thụ của dao động hóa trị C-H thơm bị lẫn vào trong dải hấp thụ của liên kết N-H. Các dao động hóa trị C-H no hấp thụ số sóng ở vùng ở 2870 - 2976 cm-1.
Các dải hấp thụ mạnh vùng 1400 - 1612 cm-1 được quy gán cho dao động hóa trị C=N và C=C của khung benzamidine.
3.1.2.2. Nghiên cứu phối tử bằng phương pháp khối phổ ESI-MS
Hình 3.3 là phổ khối lượng ESI-MS của HG. Cơ chế phân mảnh của HG trong điều kiện đo phổ được trình bày ở Hình 3.4. Sự quy gán các tín hiệu trên phổ ESI-MS của HG được đưa ra trong Bảng 3.2.
Hình 3.3. Phổ ESI-MS của HG
Bảng 3.2. Quy gán các tín hiệu trên phổ ESI-MS của HG
Phương pháp m/z thực nghiệm (%) m/z tính toán Quy gán
ESI-MS 306,1 (100%) 306,13 [HG – H]
-
292,1 (48%) 292,11 [HG – H – CH2]-
3.1.2.3. Nghiên cứu phối tử bằng phương pháp nhiễu xạ tia X đơn tinh thể
Đơn tinh thể HG phù hợp với yêu cầu của phép đo nhiễu xạ tia X đơn tinh thể được kết tinh lại trong hỗn hợp dung môi CH2Cl2/CH3OH theo tỷ lệ thể tích 1:1. Các tinh thể HG có màu vàng rất nhạt.
Bảng 3.3 trình bày các dữ kiện tinh thể học của phối tử HG. Hình 3.5 biểu diễn cấu trúc phân tử của phối tử HG xác định bằng nhiễu xạ tia X đơn tinh thể. Một số độ dài liên kết, góc liên kết trong HG được trình bày ở Bảng 3.4 và 3.5.
Bảng 3.3. Dữ kiện tinh thể học của phối tử HG
Công thức phân tử C15H21N3O2S
Khối lượng phân tử 307,18 đvC
Hệ tinh thể Đơn tà (monoclinic)