L ỜI CẢM ƠN
1.4.1. Động vật cảm nhiễm
Tất cả loài gia cầm, thủy cầm, chim hoang dã (đặc biệt là thủy cầm di trú) đều mẫn cảm với virus cúm A. Bệnh thường phát hiện khi lây nhiễm cho gia cầm (gà, gà tây, vịt, chim cút). Ngoài ra virus cúm A có thể lây bệnh cho các loài động vật có vú
như lợn, thú hoang dã, ngựa, người. Nhờđặc tính thay đổi tính kháng nguyên trong tự
nhiên, tạo nên tính thích ứng lan truyên “nội loài” như gà-gà, vịt-vịt hay “ngoại loài”
như gà - lợn, lợn - gà - người. Đặc điểm thích ứng vật chủ này tạo điều kiện cho virus cúm A tái tổ hợp các phân đoạn gene, đặc biệt các phân đoạn gene kháng nguyên
(gene “độc” HA và NA) giữa các chủng, tạo ra chủng virus mới có khảnăng thíchứng xâm nhiễm vào vật chủ mới khi chúng vượt qua được rào cản loài, chúng dễ dàng thích ứng lây nhiễm giữa giacầm với người, và người với người. Đại dịch cúm Châu Á
năm 1968, cúm A/H3N2 là kết quả của sự tổ hợp tự nhiên của virus cúm A/H2N2 của
người và virus chứa gene N3 trong tựnhiên thông qua đồng nhiễm trên lợn.
Hình 1.6. Mối quan hệ lây nhiễm và thích ứng các loài vật chủ của virus cúm A 1.4.2. Sự truyền lây bệnh
Khi gia cầm nhiễm cúm, virus nhân lên trong đường tiêu hóa và đường hô hấp, sự truyền lây được thực hiện theo 2 phương thức:
- Lây trực tiếp: do con vật mẫn cảm tiếp xúc với con vật mắc bệnh thông qua các hạt khí dung được bài tiết từ đường hô hấp hoặc qua phân, thức ăn và nước uống bị nhiễm.
thú, thức ăn, nước uống, lồng nhốt, quần áo, xe vận chuyển,...
Ngoài ra, đối với gia cầm nuôi, nguồn dịch đầu tiên thường thấy là: từ các loài gia cầm nuôi trong cùng trang trại hoặc trang trại liền kề; lây truyền qua trứng, từ gia cầm nhập khẩu, từ chim di trú, đặc biệt là các loài chim nước di trú, từngười và các
động vật có vú khác (Ban chỉđạo quốc gia phòng chống cúm, 2005).
Sự truyền lây theo chiều ngang của virus cúm gia cầm thường xảy ra nhưng
hiện nay thiếu bằng chứng về truyền lây theo chiều dọc. Tuy nhiên, trên gà mái bị
nhiễm virus cúm gia cầm, người ta có thể phân lập được virus trên vỏ trứng và các thành phần bên trong trứng. Đường gây bệnh thành công trong thí nghiệm bao gồm:
khí dung, trong mũi, trong xoang, trong khí quản, miệng, kết mạc, trong cơ, trong
xoang bụng, túi khí, mạch máu, lỗ huyệt.
1.4.3. Loài vật mang virus
Virus cúm đã được phân lập ở hầu hết các loài chim hoang dã như vịt trời, thiên nga, hải âu, vẹt, mòng biển, diều hâu, chim họ sẻ... Tuy nhiên, tần suất và sốlượng virus phân lập được ở loài thủy cầm đều cao hơn các loài khác. Điều tra thủy cầm di trú ở Bắc Mỹ cho thấy trên 60% chim non bị nhiễm virus do tập hợp đàn trước khi di trú.
Trong các loài thủy cầm thì vịt trời có tỷ lệ nhiễm virus cao hơn cả. Những virus này không gây bệnh cho vật chủ, mà được nhân lên trong đường ruột và bài thải ra ngoài, trở thành nguồn gieo rắc virus cho các loài khác, đặc biệt là gia cầm.
Cuối tháng 10/2004, OIE, FAO và WHO đã lưu ý các nước đã trải qua dịch cúm gia cầm H5N1 cho rằng vịt nuôi có thểđóng vai trò quan trọng trong việc làm lây lan chủng virus cúm gia cầm H5N1 thểđộc lực cao cho các gia cầm khỏe và rất có thể
lây truyền virus trực tiếp cho con người vì vịt nuôi và gà nhiễm bệnh cùng bài thải
lượng virus như nhau, nhưng vịt nuôi thường không thể hiện các triệu chứng lâm sàng.
FAO và OIE đã phối hợp đánh giá vai trò của vịt nuôi nhằm đưa ra chiến lược lâu dài với mục đích khống chế các ổ dịch cúm gia cầm ở châu Á (Lê Thanh Hòa, 2006).
Virus cúm A/H5N1 lưu hành ở một sốnước khu vực châu Á có độc lực với gà, chuột đã tăng lên và mở rộng phổ gây bệnh của nó trên cả loài mèo. Một sốđộng vật có
vú như cầy vằn, chồn hay chó cũng nhiễm bệnh và bài thải virus (Lê Thanh Hòa, 2006).
1.4.4. Chất chứa virus
Trong cơ thể gia cầm mắc bệnh, sau khi xâm nhập qua đường hô hấp hoặc tiêu hoá, virus nhân lên rất nhanh và xuất hiện trong các chất tiết đường hô hấp như nước mắt, nước mũi hoặc nước bọt, từđó lây lan cho các con còn lại trong đàn. Vì vậy chỉ
cần một con mắc bệnh, các con khác sẽ bị lây bệnh rất nhanh. Thời gian nung bệnh tùy thuộc vào độc lực của chủng gây bệnh. Đối với chủng độc lực cao như H5 hoặc H7, thời gian nung bệnh thường rất ngắn, trung bình khoảng 3-14 ngày.
1.4.5. Cách sinh bệnh
Đầu tiên virus xâm nhập qua đường hô hấp hay tiêu hóa và nhân lên trên tế bào niêm mạc, sau đó virus theo hệ thống mạch máu hay bạch huyết để gây nhiễm và nhân lên ở các cơ quan nội tạng, não và da. Những biểu hiện triệu chứng lâm sàng và chết xảy ra do hư hoại của các cơ quan. Sự tổn hại do virus cúm gây ra là kết quả của một trong 3 tiến trình: việc nhân lên trực tiếp của virus trong tế bào, mô và cơ quan; ảnh
hưởng gián tiếp từ sự sản sinh các tếbào trung gian như cytokine; nghẽn mạch cục bộ
do huyết khối. Đối với virus có độc lực thấp thì việc nhân lên thường giới hạn ởđường hô hấp và tiêu hóa. Gia cầm có biểu hiện bệnh và chết đa sốthường do tổn hại cơ quan hô hấp đặc biệt khi kèm theo nhiễm trùng thứ phát.
1.4.6. Mùa phát bệnh
Bệnh cúm gia cầm xảy ra quanh năm nhưng thường tập trung vào vụđông xuân
từ tháng 10 năm trước đến tháng 2-3 năm sau, khi có những biến đổi bất lợi về điều kiện thời tiết như nhiệt độ lạnh, độ ẩm cao, thời tiết biến đổi đột ngột, làm giảm sức đề
kháng tự nhiên của con vật. Mặt khác thời điểm này có mật độ chăn nuôi cao nhất
trong năm, các hoạt động buôn bán, vận chuyển, giết mổ diễn ra cao nhất trong năm
cũng là điều kiện thuận lợi để dịch bệnh phát sinh và lây lan.
1.5. Triệu chứng và bệnh tích
1.5.1. Triệu chứng chung
Thời kỳủ bệnh thường ngắn, từ vài giờ tới 3 ngày, tùy thuộc số lượng, độc lực của virus, đường nhiễm bệnh, loài cảm nhiễm virus gây bệnh. Một số nghiên cứu cho thấy thời gian ủ bệnh trong nhiều trường hợp có thểdài hơn đến 7 ngày và lâu nhất có thểđến 14 ngày (Nguyễn Mạnh Kiên, 2014).
Biểu hiện triệu chứng lâm sàng của bệnh phụ thuộc vào các yếu tố: chủng virus, số lượng virus, loài cảm nhiễm, tuổi, giới tính, điều kiện môi trường (nhiệt độ, ánh sáng, thành phần không khí,…), chếđộdinh dưỡng, tình trạng miễn dịch của vật chủ trước khi nhiễm bệnh, sự bội nhiễm của một số vi sinh vật khác.
Nhìn chung, triệu chứng lâm sàng của bệnh cúm gia cầm vô cùng phức tạp, đa
dạng trong các thể bệnh kể cả ngay trong cùng một loài gia cầm. Biểu hiện bệnh có thể
từ không hoặc có rất ít dấu hiệu lâm sàng nhưng chết đột ngột đến biểu hiện lâm sàng
điển hình và các thể bệnh nhẹ hoặc ẩn tính.
1.5.2. Triệu chứng ở chủng virus độc lực cao
Khi nhiễm các chủng virus độc lực cao (HPAI) gia cầm thường chết đột ngột, tỷ
lệ chết khá cao có khi lên đến 100% trong vài ngày. Các triệu chứng về hô hấp thường xuất hiện đầu tiên và khá điển hình như ho khẹc, hắt hơi, thở khò khè, vảy mỏ, chảy
nhiều nước mắt, nước mũi. Tiếp theo là mi mắt bị viêm, mặt phù nề, sưng mọng. Mào tích dày lên do thủy thũng, tím tái, có nhiều điểm xuất huyết. Thịt gà bị bệnh thường
thâm xám, dưới da vùng chân có xuất huyết (Bộ Nông nghiệp và PTNT, 2005).
Bên cạnh các triệu chứng về hô hấp, gia cầm bị bệnh cúm còn có biểu hiện thần
kinh: đi lại không bình thường, run rẩy, mệt mỏi, nằm li bì tụđống với nhau. Ngoài ra khi gia cầm mắc cúm thường tiêu chảy mạnh, phân loãng trắng hoặc xanh, năng suất trứng giảm mạnh (Bộ Nông nghiệp và PTNT, 2005).
1.5.3. Triệu chứng ở chủng virus cúm độc lực thấp
Gia cầm bị nhiễm các chủng virus có độc lực yếu hơn cũng có những triệu chứng tương tựnhư ở bệnh do những chủng có độc lực cao gây ra, nhưng mức độ biểu hiện nhẹhơn và tỷ lệ chết thấp hơn. Tuy nhiên, khi có sự cộng thêm với vi khuẩn hoặc virus khác có khảnăng gây bệnh hoặc điều kiện môi trường bất lợi thì tỷ lệ tử vong có thểđạt 60-70% và các triệu chứng lâm sàng cũng dần nặng hơn (Trần Hữu Cổn và Bùi Quang Anh, 2008).
1.5.4. Bệnh tích
Bệnh tích bệnh cúm rất đa dạng. Nhìn chung sẽ có các bệnh tích đặc trưng:
Mào, yếm sưng to, tím sẫm, phù mí mắt.
Phù keo nhầy và xuất huyết cơ đùi (phần giáp đầu gối). Da chân xung huyết, đỏ sẫm.
Dạdày cơ xuất huyết, đôi khi xuất huyết dạ dày tuyến như ở Newcastle Niêm mạc khí quản, niêm mạc đường tiêu hóa viêm cata và viêm tơ huyết. Khí quản phù, chứa nhiều dịch nhầy. Dịch nhầy có thểđông đặc như phomat.
Các cơ quan nội tạng như màng bao tim, màng gan, màng ruột... viêm tơ huyết. Ruột viêm cata và xuất huyết. Hạch ruột sưng.
Lách, gan, thận, phổi sưng to, hoại tử màu vàng, màu xám.
Mỡ vành tim xuất huyết. Với gà trống xuất huyết bên trong dịch hoàn.
Gà mái đẻ viêm ống dẫn trứng, vỡ trứng non.
Một số hình ảnh tổn thương đại thể cúm gia cầm
Phù keo nhầy dưới da đầu Xuất huyết da chân vùng không lông
Khí quản xuất huyết Phổi viêm, xuất huyết, phù
Mỡ phủ tạng xuất huyết Dạ dày tuyến xuất huyết Hình 1.7. Bệnh tích đại thể ở gia cầm mắc bệnh cúm A/H5N1
1.6. Các phương pháp chẩn đoán
1.6.1. Dựa vào dịch tễ học
Bệnh cúm gia cầm có tính chất lây lan nhanh và mạnh, loài mắc bệnh thường là gia cầm và các loài chim hoang dã. Gia cầm ở mọi lứa tuổi đều mắc, nhưng thường từ
4-66 tuần tuổi, đặc biệt là gia cầm trong thời kỳđẻ. Bệnh thường xảy ra vào lúc thời tiết giao mùa khi điều kiện khí hậu bất lợi (thường từtháng 11 năm trước đến tháng 3
năm sau). Bệnh xảy ra nhanh chóng, có thể từ vài giờ đến vài ngày, tỷ lệ chết rất cao, có khi 100%.
1.6.2. Dựa vào lâm sàng
1.6.2.1. Dựa vào triệu chứng
Gia cầm bị bệnh thường bị xù lông, ủ rủ, bỏăn, giảm đẻ.
Đầu, mặt sưng, phù quanh mắt. Mào yếm sưng, xuất huyết. Mắt bị viêm kết mạc và có thể bị xuất huyết.
Chân giữa vùng bàn và khuỷu bị xuất huyết. Có các triệu chứng ởđường hô hấp.
Nếu virus có độc lực cao thì gà có thể chết nhanh, gà thường chết trong vòng 24 giờ đến 48 giờ sau khi xuất hiện các triệu chứng đầu tiên (Trần Hữu Cổn và Bùi Quang Anh, 2008).
1.6.2.2. Dựa vào bệnh tích
Xuất huyết lan tràn ởcác cơ quan nội tạng.
Dưới da vùng đầu, cổ, ngực bị phù thũng.
Miệng chứa nhiều dịch.
Khí quản xuất huyết chứa nhiều dịch nhầy.
Đường tiêu hóa xuất huyết.
Gà đẻ buồng trứng xuất huyết hoặc bị viêm, có nhiều trứng non vỡ (Trần Hữu Cổn và Bùi Quang Anh, 2008).
1.6.3. Chẩn đoán bằng huyết thanh
Sử dụng các phản ứng huyết thanh học như phản ứng ngăn trởngưng kết hồng cầu (HI) hay phản ứng miễn dịch gắn men ELISA phát hiện kháng thể kháng virus trong máu của gia cầm. Phương pháp này cho kết quả chính xác cao, phát hiện nhanh và sớm bệnh cúm gia cầm.
1.6.4. Chẩn đoán bằng xét nghiệm 1.6.4.1. Khái quát Realtime PCR: 1.6.4.1. Khái quát Realtime PCR:
Real time PCR là kỹ thuật nhân bản DNA đích trong ống nghiệm thành hàng tỷ
bản sao dựa vào các chu kỳ nhiệt và kết quả khuếch đại trong ống phản ứng được hiển thị cùng lúc với phản ứng khuyếch đại xảy ra để có thểđọc được sau mỗi chu kỳ nhiệt.
Sự phát hiện sản phẩm PCR sẽ dựa vào cường độ huỳnh quang của bình phản
ứng. Hàm lượng chất phát huỳnh quang sẽ tăng dần theo chu kỳ nhiệt và tỷ lệ thuận với sản phẩm được nhân bản.
Cường độ phát huỳnh phụ thuộc vào hàm lượng chất phát huỳnh quang. Ban đầu, tín hiệu huỳnh quang còn ở tín hiệu nền nên không thể phát hiện được sự gia tăng tín
hiệu cho dù có quá trình khuếch đại và sản phẩm đã tăng theo hàm mũ. Đến một thời
điểm xác định, sản phẩm khuếch đại đã tạo ra đủ tín hiệu huỳnh quang có thể phát hiện
được. Chu kỳnày được gọi là chu kỳ ngưỡng Ct (Cycle of threshold). Đây cũng là giá trịđểđánh giá kết quả phản ứng (Phạm Hùng Vân, 2008) (Nguyễn Văn Cảm, 2005).
1.6.4.2. Nguyên lý phản ứng Real time PCR (RT-PCR)
- Phản ứng Real time PCR là một kỹ thuật PCR sử dụng các đặc điểm của quá trình sao chép DNA. Trong phản ứng PCR truyền thống, sản phẩm khuếch đại được phát hiện qua phân tích điểm kết thúc bằng cách điện di DNA trên gen agarose khi phản ứng kết thúc. Ngược lại, RT–PCR cho phép phát hiện và định lượng sự tích lũy DNA khuếch
đại ngay khi phản ứng đang xảy ra. Khảnăng này được phát hiện nhờ bổ sung vào phản
ứng những phân tử phát huỳnh quang. Những hóa chất phát huỳnh quang bao gồm thuốc nhuộm liên kết DNA và những trình tự gắn huỳnh quang liên kết đặc hiệu với primer gọi là probe. Khi DNA tương hợp với primer thì quá trình sao chép sẽ xảy ra và sựgia tăng lượng tín hiệu huỳnh quang tỷ lệ với sựgia tăng lượng DNA. Khi sử dụng máy Realtime, máy có bộ phận (Camera) có thể chụp được tín hiệu huỳnh quang khi quá trình khuếch đại xảy ra. Ban đầu, tín hiệu huỳnh quang còn ở tín hiệu nền ta không thể phát hiện sự gia
tăng tín hiệu cho dù có quá trình khuếch đại và sản phẩm đã tăng theo hàm mũ. Đến một thời điểm xác định, sản phẩm khuếch đại đã tạo ra đủ tín hiệu huỳnh quang có thể phát hiện được. Chu kỳnày được gọi là chu kỳngưỡng Ct (Cycle of threshold). Đây cũng là giá trịđểđánh giá kết quả phản ứng.
Virus cúm gia cầm type A có vật chất di truyền là RNA nên trong phản ứng real time PCR có thêm quá trình sao chép ngược từ RNA → cDNA gọi là Reverse
transcription nên phương pháp này được gọi là Real time RT-PCR.
- Nguyên lý hoạt động của probe
Hình 1.8. Cơ chế hoạt động của Taqman probe
Taqman probe được sử dụng như một trình tự oligonucleotide đặc hiệu, gắn chất huỳnh quang gọi là mẫu dò Taqman probe, cùng với các primer.
Taqman probe gắn một chất phát huỳnh quang ở đầu 5’ và một chất hấp phụ
huỳnh quang ởđầu 3’. Khi còn nguyên vẹn, tín hiệu của chất phát huỳnh quang bị hấp thụ do nó nằm gần chất hấp phụ. Trong giai đoạn kết hợp bắt gặp và kéo dài DNA trong phản ứng khuếch đại, probe liên kết với trình tự đích và hoạt động 5’-3’
exonuclease đặc hiệu cho DNA mạch đôi của Taq sẽ cắt đứt đầu gắn chất huỳnh quang. Kết quả chất huỳnh quang bị tách khỏi chất hấp phụ và tín hiệu huỳnh quang phát ra tỷ lệ với lượng sản phẩm khuếch đại trong mẫu.
1.6.5. Phân lập và định danh virus
Để phân lập virus thường sử dụng mẫu bệnh phẩm là phổi, khí quản, não, lách. Bệnh phẩm sau khi xửlí được tiêm vào phôi gà 9-11 ngày tuổi, ấp 37oC trong 7 ngày thì thu hoạch trứng. Virus cũng có thể phân lập trên môi trường tế bào, sau khi phân lập được virus từmôi trường tế bào hoặc trên phôi trứng thì có thểgiám định virus bằng HI test
đểgiám định subtype H và N.
Gần đây, phương pháp Realtime PCR (RT-PCR) trực tiếp sử dụng nguồn gen của virus cúm A và cúm A/H5N1 từ mẫu bệnh phẩm cũng được đưa vào ứng dụng cho phép chẩn đoán chính xác, tin cậy cao và phân biệt sự hiện diện của các chủng virus cúm