L ỜI CẢM ƠN
2.2.1. Xác định sự lưu hành virus bằng phương pháp Realtime RT-PCR
2.2.1.1. Thiết bị và dụng cụ
- Tủ lạnh âm -20 0C, -80 0C; tủ lạnh thường 2- 8 0C. - Tủấm 37 0C.
- Buồng an toàn sinh học cấp II, buồng an toàn sinh học PCR. - Hệ thống chiết xuất RNA bằng chân không hoặc ly tâm.
- Máy ly tâm lạnh ống eppendorf, máy ly tâm ống lớn, máy ly tâm ống nhỏ. - Bể hấp cách thủy, máy trộn ống nghiệm.
- Bộ micropipet các cỡ, ống eppendorf có thể tích khác nhau, các ống đựng
nguyên liệu 15ml, 50ml, tube PCR, giá đỡ tube PCR, đĩa chạy PCR.
- Đầu típ các cỡ 10, 20, 100, 200 và 1000µl sử dụng cho micropipet (có lọc và không lọc).
- Bình tam giác, ống đong thủy tinh, cốc có mỏ...
- Tăm bông, dụng cụ bảo hộ khác (găng tay, khẩu trang...).
2.2.1.2. Nguyên liệu và hóa chất:
- Mẫu bệnh phẩm: dịch hầu họng (swabs) của gia cầm.
- Các loại hóa chất: Na2HPO4, Na2HPO4.H2O, NaCl, HCl, NaOH. -Nước dùng cho sinh học phân tử không có Rnase.
- Ethanol tuyệt đối.
- Kít chiết tách RNA QIAamp® Viral RNA Mini KIT
- Nguyên liệu nhân gen Invitrogen Superscrip One-step RT-PCR Kít. - PBS 0,01M pH = 7,2 (phosphate buffered saline).
- MgCl2 (Promega) 25mM.
PPP Name (Source) Primer/ Probe Sequence (5 ’ -3’) 5’ 3’ Matrix
Probe TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG FAM BHQ1
Forward CATGGARTGGCTAAAGACAAGACC None None
Reverse AGGGCATTTTGGACAAAKCGTCTA None None
H5-9S
Probe FAM-TCAACAGTGGCGAGTTCCCTAGCA-
BHQ1 FAM BHQ1
Forward ACATATGACTACCCACARTATTCAG None None
Reverse 1 AGACCAGCTAYCATGATTGC None None
Reverse 2 AAACCAGCCACTATGATTGC None None
N1-2 China
Probe TGGTCTTGGCCAGACGGTGC FAM BHQ1
Forward TGGACTAGTGGGAGCAGCAT None None
Reverse TGTCAATGGTTAAGGGCAACTC None None
N6-1 Probe FAM- CCAATAACAGGAGGGAGCCCAGACCC- BHQ1 FAM BHQ1
Forward CCCCACCAATGGGAACTG None None
Reverse TCTAGGAATGCAAACCCTTTTACC None None
H7-6 Coda
Probe 5’-FAM- TGGTTTAGCTTCGGGGCATCATG -
BHQ1-3’ FAM BHQ1
Forward 5’- GYAGYGGYTACAAAGATGTG -3’ None None Reverse 5’- GAAGACAAGGCCCATTGCAA -3’ None None
N9-1 CNIC
Probe 5’-FAM-AGACAATCCCCGACCGAATGACCC
-BHQ1-3’ FAM BHQ1
Forward 5’- TAGCAATGACACACACTAGTCAAT -3’ None None Reverse 5’- ATTACCTGGATAAGGGTCATTACACT -3’ None None