L ỜI CẢM ƠN
1.7.2. Phòng bệnh bằng vắc xin
Đối với bệnh truyền nhiễm, vắc xin được coi là biện pháp có tính chiến lược, hữu hiệu nhằm ngăn chặn lây lan, tạo bảo hộ miễn dịch. Đối với dịch cúm A/H5N1 ở
gia cầm và dự phòng dịch cúm trên người, nghiên cứu phát triển vắc xin không những ngăn ngừa làm giảm được bệnh ở gia cầm, mà còn khống chế nguồn truyền lây của loại virus nguy hiểm này sang người.
Năm 1970, Lang GO và cộng sựđã dùng Adamantadin đểđiều trị bệnh cúm gia cầm ở gà Tây cho kết quả khá tốt, chữa khỏi được bệnh trên 60% gà bệnh (Lê Văn Năm, 2004).
Năm 1984, Beard. C.W. và 1985 Webster đã lập lại việc điều trị bệnh cúm gà bằng Adamatadin kết hợp với Rimantadin và đã giảm 50% tỷ lệ gà chết so với lô
đối chứng (Beard và cs, 1984; Wu và cộng sự, 2008).
Năm 2004 Nhật Bản đã giới thiệu một loại thuốc Anti - flu có thểđiều trịđược bệnh cúm gia cầm (Lê Văn Năm, 2004).
Việc sử dụng các thuốc trên tuy có làm giảm tỷ lệ chết nhưng không thay đổi tỷ
lệ nhiễm và gia cầm vẫn tiếp tục bài thải virus. Hiện nay đã có các loại thuốc chống cúm mới nhất là những loại có tác dụng ức chế neuraminidase như Tamiflu hay Zanamivir nhưng vẫn bị kháng thuốc tương đối nhiều và còn có nhiều tác dụng phụ (Vũ Thị Mỹ
Hạnh và cs, 2008).
Một số loại vắc xin được ghi nhận hiện nay (Lê Văn Năm, 2004):
- Vắc xin đồng chủng (Homologous): Đây là loại vắc xin vô hoạt có cùng kháng nguyên H và N với virus gây bệnh ngoài thực địa, nên có khảnăng đáp ứng miễn dịch tốt chống lại virus gây bệnh cường độc và đã được sử dụng ở Pakistan, Mehico và Mỹ.
Hạn chế của loại vắc xin này là không loại bỏ được tận gốc sự lây nhiễm virus cúm tức là không loại trừđược khảnăng thâm nhập virus cường độc vào cơ thể gà. Nếu sử dụng vắc xin loại này thì trình độ khoa học thế giới ngày nay chưa đủđể phân biệt rõ đàn gia cầm nào đã được tiêm phòng và chưa được tiêm vắc xin... Đây là một trở ngại lớn nhất, là nguyên nhân dẫn đến sự lúng túng, do dự và trì trệ trong việc quyết đoán giải pháp cần lựa chọn mà hậu quả dẫn đên khôn lường: bệnh nhanh chóng trở thành dịch có xu thếthành đại dịch, tạo điều kiện thuận lợi cho việc biến chủng và
tăng tính độc lực của virus cúm.
- Vắc xin dị chủng: Đây cũng là một vắc xin vô hoạt có cùng thành phần kháng
nguyên H nhưng kháng nguyên N khác với virus gây bệnh cúm thực địa. Ưu điểm nổi bật của loại vắc xin này là cho phép chúng ta có thể phân biệt được đàn gia cầm chưa tiêm và đã được tiêm vắc xin.
Tuy nhiên muốn làm được điểu này chúng ta phải có cả một ngân hàng vắc xin
đủ chủng loại, đủcơ sốđể sử dụng ngay trong trường hợp khẩn cấp. Đồng thời phải có một hệ thống y tế dự phòng đủ mạnh để kiểm soát dịch.
- Vắc xin tái tổ hợp: Đây là loại vắc xin được chế tạo theo công nghệgen trên cơ
sở nguyên tắc của vắc xin dị chủng. Tức là có kháng nguyên H tương đồng với kháng nguyên H của virus thực địa, nhưng kháng nguyên N lại khác căn bản với kháng nguyên N của virus cường độc.
* Tình hình sử dụng vắc xin trên thế giới và khuyến cáo của OIE
- Sử dụng vắc xin vào mục đích khống chế dịch bệnh cúm gia cầm chỉ là một giải pháp hỗ trợđể dập dịch, khoanh vùng dịch và khống chế dịch và vắc xin chỉ hạn chế bài xuất virus cường độc ra ngoài môi trường chứ không loại bỏđược tận gốc bệnh cúm.
- Chỉ tiêm phòng vắc xin khi thật khẩn cấp.
- Để có quyết định tiêm phòng phải dựa vào năng lực và điều kiện sau: phải có hệ thống chẩn đoán đủ năng lực xác định được cúm gia cầm có độc lực cao (HPAI)
hay có độc lực thấp (LPAI); có ngân hàng vắc xin đủ các chủng loại kháng nguyên H và N nhằm hạn chế tối đa hậu quả biến chủng virus cúm sau khi tiêm phòng; có hệ
thống kiểm soát thú y chặt chẽ từtrung ương đến địa phương nhằm kiểm soát những
đàn đã sử dụng vắc xin với những đàn chưa sử dụng vắc xin.
Với những điều kiện trên thì nước ta còn gặp nhiều khó khăn, do vậy việc tiêm phòng, quản lí tiêm phòng chưa được triệt để. Tuy nhiên với những nỗ lực của ngành từ những năm 2004, 2005 đã có nhiều đề tài, dự án thử nghiệm và khảo nghiệm vắc xin cúm đã được triển khai và thu được kết quả khả quan (Nguyễn Tùng và cộng sự, 2011).
CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng, phạm vi và nội dung
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu:
Gà, vịt được nuôi tại một số hộ chăn nuôi trên địa bàn huyện Quảng Trạch và tại chợ buôn bán gia cầm sống thị xã Ba Đồn, tỉnh Quảng Bình.
2.1.2. Phạm vi nghiên cứu:
2.1.2.1. Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 5/2017 đến tháng 02/2018.
2.1.2.2. Địa điểm nghiên cứu: Đề tài được thực hiện tại huyện Quảng Trạch và thị xã
Ba Đồn, tỉnh Quảng Bình.
- Địa điểm điều tra dịch tễ: tại 5 xã huyện Quảng Trạch.
- Địa điểm lấy mẫu giám sát: tại các hộchăn nuôi gia cầm huyện Quảng Trạch và chợ buôn bán gia cầm sống thị xã Ba Đồn.
Địa điểm xét nghiệm mẫu: tại Phân viện Thú y miền trung.
2.1.3. Nội dung nghiên cứu
- Xác định một số yếu tốnguy cơ làm phát sinh và lây lan dịch cúm gia cầm tại huyện Quảng Trạch.
- Khảo sát sựlưu hành của virus cúm gia cầm trên địa bàn huyện Quảng Trạch và thị xã Ba Đồn.
- Giải trình tự gen HA (H5) của chủng virus cúm gia cầm tại huyện huyện Quảng Trạch và thị xã Ba Đồn, so sánh với chủng tương đồng đã tìm thấy ở Việt Nam và khu vực lân cận.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Xác định sự lưu hành virus bằng phương pháp Realtime RT-PCR
2.2.1.1. Thiết bị và dụng cụ
- Tủ lạnh âm -20 0C, -80 0C; tủ lạnh thường 2- 8 0C. - Tủấm 37 0C.
- Buồng an toàn sinh học cấp II, buồng an toàn sinh học PCR. - Hệ thống chiết xuất RNA bằng chân không hoặc ly tâm.
- Máy ly tâm lạnh ống eppendorf, máy ly tâm ống lớn, máy ly tâm ống nhỏ. - Bể hấp cách thủy, máy trộn ống nghiệm.
- Bộ micropipet các cỡ, ống eppendorf có thể tích khác nhau, các ống đựng
nguyên liệu 15ml, 50ml, tube PCR, giá đỡ tube PCR, đĩa chạy PCR.
- Đầu típ các cỡ 10, 20, 100, 200 và 1000µl sử dụng cho micropipet (có lọc và không lọc).
- Bình tam giác, ống đong thủy tinh, cốc có mỏ...
- Tăm bông, dụng cụ bảo hộ khác (găng tay, khẩu trang...).
2.2.1.2. Nguyên liệu và hóa chất:
- Mẫu bệnh phẩm: dịch hầu họng (swabs) của gia cầm.
- Các loại hóa chất: Na2HPO4, Na2HPO4.H2O, NaCl, HCl, NaOH. -Nước dùng cho sinh học phân tử không có Rnase.
- Ethanol tuyệt đối.
- Kít chiết tách RNA QIAamp® Viral RNA Mini KIT
- Nguyên liệu nhân gen Invitrogen Superscrip One-step RT-PCR Kít. - PBS 0,01M pH = 7,2 (phosphate buffered saline).
- MgCl2 (Promega) 25mM.
PPP Name (Source) Primer/ Probe Sequence (5 ’ -3’) 5’ 3’ Matrix
Probe TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG FAM BHQ1
Forward CATGGARTGGCTAAAGACAAGACC None None
Reverse AGGGCATTTTGGACAAAKCGTCTA None None
H5-9S
Probe FAM-TCAACAGTGGCGAGTTCCCTAGCA-
BHQ1 FAM BHQ1
Forward ACATATGACTACCCACARTATTCAG None None
Reverse 1 AGACCAGCTAYCATGATTGC None None
Reverse 2 AAACCAGCCACTATGATTGC None None
N1-2 China
Probe TGGTCTTGGCCAGACGGTGC FAM BHQ1
Forward TGGACTAGTGGGAGCAGCAT None None
Reverse TGTCAATGGTTAAGGGCAACTC None None
N6-1 Probe FAM- CCAATAACAGGAGGGAGCCCAGACCC- BHQ1 FAM BHQ1
Forward CCCCACCAATGGGAACTG None None
Reverse TCTAGGAATGCAAACCCTTTTACC None None
H7-6 Coda
Probe 5’-FAM- TGGTTTAGCTTCGGGGCATCATG -
BHQ1-3’ FAM BHQ1
Forward 5’- GYAGYGGYTACAAAGATGTG -3’ None None Reverse 5’- GAAGACAAGGCCCATTGCAA -3’ None None
N9-1 CNIC
Probe 5’-FAM-AGACAATCCCCGACCGAATGACCC
-BHQ1-3’ FAM BHQ1
Forward 5’- TAGCAATGACACACACTAGTCAAT -3’ None None Reverse 5’- ATTACCTGGATAAGGGTCATTACACT -3’ None None
2.2.2. Bố trí thí nghiệm
2.2.2.1. Lấy mẫu xét nghiệm
2.2.2.1.1. Kỹ thuật lấy và bảo quản mẫu
- Lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển được thực hiện theo Quy chuẩn Việt Nam QCVN 01-83:2011/BNNPTNT quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về bệnh động vật- yêu cầu chung lấy mẫu bệnh phẩm bảo quản và vận chuyển.
- Lấy mẫu dịch hầu họng (swab): đưa tăm bông vào sâu trong họng rồi ngoáy, thu dịch nhầy sau đó từ từrút ra đưa vào ống chứa dung dịch bảo quản mẫu bằng đệm PBS 0,01M pH = 7,2, bẻ que cho vừa với chiều dài của ống, đóng kín nắp. Mẫu sau khi lấy được bảo quản và gửi về Phân viện thú y Miền Trung để tiến hành xét nghiệm.
- Mẫu sau khi được lấy tại các hộchăn nuôi được bảo quản bảo quản lạnh 2oC- 8oC và gửi về Phân viện Thú y miền trung để tiến hành xét nghiệm xác định sự lưu
hành của virus CGC.
- Thực hiện thu mẫu swab tại chợ, trang trại chăn nuôi: mẫu được lấy ngẫu nhiên từ các hộ buôn bán gia cầm sống, các trang trại chăn nuôi gia cầm trên địa bàn huyện bàn huyện Quảng Trạch và thị xã Ba Đồn.
2.2.2.1.2. Thời điểm lấy mẫu: định kỳ cứ đầu tuần thứ 4 của tháng lấy 02 mẫu gộp/tháng/hộ, chợ.
2.2.2.1.3. Sốlượng mẫu
- Tại huyện Quảng Trạch: để giám sát sự lưu hành type virus cúm gia cầm chúng tôi tiến hành lấy mẫu dịch hầu họng luân phiên tại các hộchăn nuôi ngẫu nhiên trong 5 xã, mổi tháng lấy 01 xã, từtháng 5/2017 đến tháng 02/2018, tổng số 20 mẫu gộp tương đương 200 mẫu đơn/10 tháng.
- Tại chợ buôn bán gia cầm sống thị xã Ba Đồn: Mẫu được lấy thường xuyên ngẫu nhiên tại các hộ buôn bán gà sống từ tháng 5/2017 đến tháng 02/2018, tổng số 20 mẫu gộp tương đương 200 mẫu đơn /10 tháng.
2.2.2.2. Phiếu điều tra
- Để nghiên cứu đặc điểm dịch tễ bệnh cúm gia cầm trên địa bàn huyện Quảng
Trạch từ năm 2012 đến năm 2017, chúng tôi sử dụng các kênh thông tin như báo cáo của Chi cục Chăn nuôi và Thú y, báo cáo của Trạm Chăn nuôi và Thú y huyện Quảng
Trạch về tổng số hộ nuôi, số hộ bị bệnh cúm gia cầm và phân bố hộ nuôi gia cầm trên
địa bàn huyện Quảng Trạch. Các dữ liệunày là cơ sở để xác định số phiếu điều tra và phân bố phiếuđiều tra cho hợp lý.
- Số phiếu điều tra được chọn ngẫu nhiên để điều tra tại 05 xã, trong đó 02
xã có dịch và 03 xã không có dịch năm 2012, mổi xã 20 phiếu; ưu tiên lựa chọn các xã ổ dịch cũ, vùng nguy cơ cao.
Bảng 2.1. Phân bố số lượng phiếu điều tra
TT Các xã điều tra Tổng đàn gia cầm (con) Số phiếu điều tra
1 Quảng Hưng 18.050 20 2 Quảng Xuân 16.200 20 3 Quảng Phương 32.400 20 4 Quảng Lưu 26.800 20 5 Quảng Thanh 7.500 20 Cộng 100.950 100
* Ghi chú: Mẫu phiếu điều tra sẽ được lấy theo ngẫu nhiên phân nhóm, từđó
tổng hợp, phân tích và đánh giá mức độnguy cơ phát sinh và lây lan bệnh.
2.2.3. Phương pháp Realtime RT-PCR
2.2.3.1. Nguyên liệu dùng cho phương pháp Realtime RT-PCR.
- Khuôn RNA là đoạn cần nhân bản. - Nước cất vô trùng (Rnase-free).
- RNA đối chứng dương tính M, H5 của virus cúm A/H5N1, A/H5N6. - Hai đoạn mồi oligonucleotit (primer) và probe (mẫu dò).
- Enzym DNA polymerase chịu nhiệt.
- Các nucleotit tự do: dATP, dGTP, dCTP, dTTP. - Dung dịch đệm, Mg2+...
2.2.3.2. Các bước tiến hành phản ứng Realtime RT-PCR
2.2.3.2.1. Xử lý mẫu dùng cho chiết tách RNA tổng số
- Vortex ống mẫu (15-30s), bỏ tăm bông, để mẫu lắng cặn khoảng 30 phút ở
nhiệt độ phòng.
- Bảo quản 40C trong thời gian ngăn (48h). Nếu lưu mẫu thời gian dài thì để ở
âm 700C.
2.2.3.2.2. Chiết tách RNA bằng kit QIAamp Viral RNR Mini
- Cho 560l dung môi AVL vào ống 1,5ml. Cho tiếp 5,6l dung môi carrier RNA. - Cho tiếp 140l dung dịch mẫu. Sau đó vortex trong 15 giây.
- Ủở nhiệt độ phòng (15-200C) trong 10 phút, sau đó ly tâm nhanh.
- Cho vào 560l Ethanol (96-100%). Vortex trong 15 giây, sau đó ly tâm nhanh.
- Chuyển 630l hỗn dịch vào cột lọc với ống thu (collection tube). Ly tâm trong 1 phút ở 6,000g (8000rpm) ở nhiệt độ phòng. Chuyển cột lọc qua ống thu mới.
- Cho 500l dung môi AW1 vào cột lọc. Ly tâm 1 phút ở 6.000g (8.000rpm) ở
nhiệt độ phòng. Chuyển cột lọc vào ống 1,5ml mới.
- Cho 60l dung môi AVE vào cột lọc. Ủ 1 phút ở nhiệt độ phòng.
- Ly tâm 1 phút ở 6.000g (8.000rpm). Bảo quản dung dịch RNA ở âm 200C trong thời gian ngắn (1-2 ngày), ở âm 700C trong thời gian dài.
2.2.3.2.3. Chuẩn bị hỗn hợp nhân gene (master mix)
Quá trình chuẩn bị master mix được tiến hành trong buồng vô trùng. Chuẩn bị ống eppendorf, tiến hành vortex và spin các ống nguyên liệu sau đó lần lượt cho vào
ống eppendorf các thành phần với lượng như dưới.
Bảng 2.2. Thành phần của master mix
TT Nguyên liệu Lượng (µl)
1 DW 4,3
2 2X ReactionBuffer 7,5
PPP
Primer forward (40uM)
0,9 Primer reverse (40uM)
Probe (10uM)
3 Enzyme mix 0,3
Sau khi cho các chất trên vào ống eppendorf tiến hành vortex và spin trong thời gian 10 - 15 giây.
2.2.3.2.4. Thực hiện phản ứng
Trước khi tiến hành các phản ứng cần chuẩn bị một số ống eppendorf 0,2 ml
tương ứng với sốlượng mẫu cần chẩn đoán. Sau đó tiến hành các bước sau: - Cho 13µl hỗn hợp master mix vào các tube 0,2 ml.
- Cho 2µl nước free RNase vào hỗn hợp master mix của tube đối chứng âm. - Cho 2µl RNA mẫu đã chiết tách được ở trên vào hỗn hợp master mix của các tube mẫu.
- Cho 2µl mẫu đối chứng dương vào hỗn hợp master mix của tube đối chứng
dương.
Khi thực hiện phải tuân thủ theo trình tự trên, sau mỗi lần cho mẫu vào phải tiến
hành đậy nắp ống phản ứng để tránh tạp nhiễm. Phải sử dụng đúng loại pipet để cho mẫu vào phản ứng theo quy định. Cho toàn bộ các ống phản ứng vào spin down để khỏi dính vào thành ống rồi chuyển sang phòng chạy PCR.
2.2.3.2.5. Chu trình nhiệt chương trình Realtime RT PCR
Trước khi cài đặt, vận hành máy cần đặt các tube phản ứng vào giếng (well) của máy. Khởi động màn hình máy tính và kích biểu tượng Biorad để tiến hành cài đặt máy. Khai báo vị trí mẫu, cài đặt màu cho probe và cài đặt chu trình nhiệt. Sau khi khai báo xong thì bắt đầu chạy máy.
Invitrogen One-step RT-PCR Kít thực hiện phản ứng RT-PCR theo chu trình luân nhiệt trên máy Biorad như bảng dưới đây.
Bảng 2.3. Chu trình luân nhiệt của phản ứng RT-PCR
Quá trình Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ
RT 50 0 C 15phút 1 950C 2 phút PCR 95 0 C 10 giây 40 600C 40 giây 2.2.3.2.6. Đọc kết quả
Sau khi kết thúc phản ứng RT-PCR, nếu trong mẫu dịch có virus cúm A/H5N1; A/H5N6; A/H7N9 trình tự nucleotit của các gen M, H5, H7 và N1, N6, N9 sẽđược
của virus thông qua phần mềm tạo đường cong và chu kỳ ngưỡng (Ct). Kết quả xét nghiệm từng chỉtiêu căn cứ vào giá trị Ct:
- Đối chứng dương tính cho giá trị Ct dao động trong khoảng ±2 so với giá trị Ct đã biết.
- Đối chứng âm tính không có giá trị Ct.
- Mẫu dương tính khi đường cong khuyếch đại tương tự như đường cong đối chứng dương và giá trị Ct ≤ 35.
- Kết quả được xem là âm tính, khi không có sự khuếch đại đặc hiệu, đường cong khuếch đại giống như đối chứng âm tính và không cho giá trị Ct.
- Mẫu được xác định là nghi ngờ khi đường cong khuếch đại giống đối chứng