4. NHỮNG ĐIÍ̉M MỚI CỦA ĐÍ̀ TÀI
1.3.7. Câc nghiín cứu về bệnh hĩo xanh vi khuẩn trín că chua ở Việt Nam
Lí Lương Tề vă cs (2002) [24], bằng kỹ thuật PCR vă đânh giâ tính khâng bệnh hĩo xanh của một số giống că chua, tâc giả đê phât hiện được vi khuẩn Ralstonia solanacearum phđn lập từ cđy că chua có triệu chứng hĩo xanh điển hình thu thập từ 6 tỉnh miền Bắc vă xâc định được câc dòng/giống că chua có nguồn gen CRA66, CRA- 84-26-3, UPCA1169, PT127805A vă nhóm Hawaii 7997 lă những giống có tính khâng cao - trung bình, có nhiều triển vọng trong công tâc chọn tạo giống că chua khâng bệnh HXVK.
Theo kết quả nghiín cứu của Chu Văn Chuông (2005) [7], tỷ lệ bệnh HXVK trín că chua ở đồng bằng sông Hồng vụ Đông sớm vă vụ Xuđn Hỉ dao động từ 13-28%, vụ Đông dao động từ 10-18%. Sử dụng câc giống că chua mang gen khâng vă ghĩp că chua trín gốc că tím khâng hĩo xanh sẽ mang lại hiệu quả tốt trong phòng chống bệnh HXVK. Ngoăi ra, tâc giả cũng đề xuất một quy trình phòng trừ tổng hợp bệnh HXVK hại că chua.
Vừa qua, Ngô Quang Vinh (Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam) đê thử ứng dụng những tiến bộ khoa học kỹ thuật mới văo điều kiện Việt Nam vă đê thu được kết quả rất có triển vọng. Nội dung chính lă tìm được cđy că chua hay că tím khâng bệnh hĩo rũ tốt để lăm gốc ghĩp, rồi dùng cđy că chua có năng suất cao, quả có hình dạng đẹp để lăm cănh ghĩp. Sau đó ghĩp ngọn cđy că chua năy lín gốc ghĩp khâng được bệnh, ta sẽ có cđy că chua khâng được bệnh hĩo rũ. Công việc năy được nhiều bă con nông dđn ở hai huyện Đức Trọng vă Đơn Dương (tỉnh Lđm Đồng) thực hiện vă đê thu được những ruộng că chua sạch bệnh, không tốn thuốc nín că chua của họ sản xuất ra được gọi lă că chua an toăn, năng suất cao 1,5-2 lần so với ruộng đối chứng.
Bín cạnh việc nghiín cứu bệnh HXVK trín că chua vă những biện phâp quản lý, phòng chống bệnh HXVK một câch hiệu quả thì trong thời gian qua chúng ta mới chỉ nhập nội giống vă sản xuất hạt giống că chua với mục đích ăn tươi lă chính. Việc xâc định được bộ giống că chua chế biến đâp ứng câc yíu cầu tiíu chuẩn chế biến như độ Brix, độ axit vă câc tiíu chuẩn khâc vẫn còn mới mẻ. Việc kết luận được một bộ giống că chua chế biến thích nghi với điều kiện đất đai, sinh thâi, khí hậu từng nơi để có khả năng chống chịu sđu bệnh vă câc điều kiện ngoại cảnh, có năng suất cao, chất lượng tốt lă vô cùng quan trọng.
1.4. ĐÂNH GIÂ ĐA DẠNG DI TRUYỀN
1.4.1. Tổng quan đa dạng sinh học - đa dạng di truyền
Theo công ước Đa dạng sinh học, khâi niệm "Đa dạng sinh học" có nghĩa lă: sự khâc nhau giữa câc sinh vật sống ở tất cả mọi nơi, bao gồm: câc hệ sinh thâi trín cạn, trong đại dương vă câc hệ sinh thâi thủy vực khâc, cũng như câc phức hệ sinh thâi mă câc sinh vật lă một thănh phần, thuật ngữ năy bao hăm sự khâc nhau trong một loăi, giữa câc loăi vă giữa câc hệ sinh thâi."
Đa dạng sinh học lă vấn đề rất được quan tđm hiện nay. Gìn giữ vă bảo tồn đa dạng sinh học lă mục tiíu sống còn trong việc duy trì cđn bằng sinh thâi, đảm bảo môi sinh của câc sinh vật trín Trâi Đất. Khâi niệm đa dạng sinh học được hiểu theo nhiều cấp, đó có thể lă sự đa dạng của câc quần xê sinh vật trong hệ sinh thâi, lă sự đa dạng giữa câc loăi trong quần xê hay sự đa dạng ở cấp độ di truyền giữa câc câ thể trong cùng một loăi. Mặc dù lă cấp độ thấp nhất nhưng đa dạng di truyền có vai trò vô cùng quan trọng trong tiến hóa vă thích nghi của câc sinh vật, mọi biến động ở cấp độ đa dạng di truyền đều có những tâc động đến những cấp độ cao hơn vă cuối cùng lă ảnh hưởng đến đa dạng sinh học.
Đa dạng di truyền lă biểu hiện sự đa dạng của câc biến dị có thể di truyền trong một loăi, một quần xê hoặc giữa câc loăi, câc quần xê. Xĩt cho cùng, đa dạng di truyền chính lă sự biến dị của sự tổ hợp trình tự của bốn bazo cơ bản, thănh phần axit nucleic, tạo thănh mê di truyền.
Đa dạng di truyền lă kết quả của quâ trình biến đổi trong vật chất di truyền sinh vật (trình tự DNA, số lượng cấu trúc nhiễm sắc thể) theo câc con đường tự nhiín (lai, phđn ly - tâi tổ hợp) hay bởi băn tay con người (lai - chọn tạo giống, chuyển gen). Tất cả những quâ trình năy gđy nín những biến đổi trong gen vă tần số alen, dẫn đến những thay đổi trong kiểu hình của sinh vật.
Đa dạng di truyền có vai trò vă ý nghĩa hết sức quan trọng trong công nghệ sinh học nông nghiệp. Từ những kết quả đânh giâ đa dạng di truyền, câc nhă khoa học có thể quy hoạch vă bảo tồn câc nguồn gen quý nhằm duy trì đa dạng sinh học hoặc hỗ
trợ quâ trình lai - chọn tạo giống thông qua chọn lựa câc cặp bố mẹ trong câc phĩp lai nhằm thu được ưu thế lai cao nhất.
1.4.2. Ý nghĩa của việc nghiín cứu đa dạng di truyền
Đa dạng di truyền lă cơ sở cho việc tuyển chọn lai tạo những giống, loăi mới; đa dạng về loăi thường lă đối tượng khai thâc phục vụ mục đích kinh tế; đa dạng về hệ sinh thâi có chức năng bảo vệ môi trường sống; đồng thời câc hệ sinh thâi được duy trì vă bảo vệ chính lă nhờ sự tồn tại của câc quần thể loăi sống trong đó.
Giâ trị của đa dạng di truyền thể hiện ở ba mặt chính:
- Giâ trị ổn định (Portfolio Value): Đa dạng di truyền tạo ra sự ổn định cho câc hệ thống nông nghiệp ở quy mô toăn cầu, quốc gia vă địa phương. Sự thiệt hại của một giống cđy trồng cụ thể được bù đắp bằng năng suất của câc giống hoặc cđy trồng khâc.
- Giâ trị lựa chọn (Option Value): Đa dạng di truyền tạo ra bảo hiểm sinh học cần thiết chống lại những thay đổi bất lợi của môi trường do việc tạo ra những tính trạng hữu ích như tính khâng sđu bệnh hay tính thích nghi. Giâ trị của đa dạng di truyền được thể hiện thông qua việc sử dụng vă khai thâc câc tính trạng quý, hiếm của tăi nguyín di truyền thực vật như tính chống chịu, năng suất, chất lượng vă khả năng thích nghi.
- Giâ trị khai thâc (Exploration Value): Đa dạng di truyền được xem lă kho dự trữ tiềm năng câc tăi nguyín chưa biết đến. Đđy cũng lă lý do cần phải duy trì cả câc hệ sinh thâi hoang dê lẫn câc hệ thống nông nghiệp truyền thống.
Ngoăi ra, đa dạng di truyền còn có giâ trị về thẩm mỹ (thưởng thức, giải trí) vă giâ trị về đạo đức. Có một số loăi có cả giâ trị sử dụng, thẩm mỹ vă đạo đức; song về giâ trị cũng không phải đều nhau giữa câc mặt giâ trị vă giữa câc loăi [22].
1.4.3. Câc phương phâp nghiín cứu đa dạng di truyền
Đa dạng di truyền giữa câc nguồn vật liệu có thể được đânh giâ thông qua việc xâc định khoảng câch di truyền giữa chúng vă dựa trín cơ sở dữ liệu phả hệ, chỉ thị sinh hóa, chỉ thị phđn tử như chị thị isozyme vă gần đđy lă chỉ thị DNA.
Câc chỉ thị DNA có thể được chia lăm hai nhóm chính sau: chỉ thị phđn tử dựa trín cơ sở lai DNA hay chỉ thị RFLP dựa văo câc băng DNA trín gel điện di có thể phât hiện câc thể đồng hợp tử hoặc dị hợp tử vă chỉ thị phđn tử dựa trín cơ sở nhđn bản DNA bằng kỹ thuật PCR như RAPD, AFLP, SSR,...Trong những năm gần đđy, nhiều chỉ thị thuộc nhóm năy đê thănh công trong nghiín cứu đa dạng di truyền.
1.4.3.1. Chỉ thị sinh hoâ
Chỉ thị sinh hóa được phât hiện nhờ phương phâp izozyme, dựa trín cơ sở gen quy định sự tổng hợp protein. Izozyme lă enzym cùng xúc tâc cho một phản ứng trong
tế băo nhưng do câc locus gel quy định. Câc enzym có bản chất lă protein vă lă chất đa điện ly nín trong dung dịch nó ở trạng thâi phđn cực. Khi chịu tâc dụng của dòng điện một chiều, câc phđn tử protein khâc nhau về kích thước, khối lượng phđn tử, lực tĩnh điện,…sẽ chuyển động với tốc độ khâc nhau vă sẽ phđn bố ở vị trí khâc nhau trín gel sau khi điện di.
Câc phđn tử protein enzyme lă do gen quy định. Trong quâ trình tiến hóa, dưới tâc dụng của điều kiện môi trường bín ngoăi vă bín trong cơ thể, câc gen biến đổi hình thănh câc alen khâc nhau vă nó mê hóa cho quâ trình tổng hợp câc phđn tử protein khâc nhau [11].
Có thể chia izozyme thănh 2 dạng:
- Izozyme đơn gen: câc izozyme năy chịu sự kiểm soât của 1 gen.
- Izozyme đa gen: câc izozyme chịu sự kiểm soât của nhiều gen (đa gen).
Việc phđn tích izozyme chúng ta phât hiện những alen đồng trội vă đđy lă phương phâp tương đối rẻ tiền, dễ tiến hănh hơn câc phương phâp sử dụng chỉ thị DNA. Tuy nhiín, với số lượng ít ỏi izozyme, chúng chỉ thể hiện ở những giai đoạn nhất định của quâ trình phât triển câ thể vă thực tế nó cũng chỉ lă sản phẩm của gen nín chưa phản ânh được chính xâc bản chất di truyền của câc câ thể. Do vậy, việc sử dụng chỉ thị izozyme còn có những hạn chế nhất định [12].
1.4.3.2. Chỉ thị di truyền
Câc chỉ thị phđn tử được phât hiện thông qua phương phâp đânh dấu câc đoạn Oligonucleotide vă đều có một số đặc điểm chung lă:
+ Không bị ảnh hưởng bởi câc yếu tố môi trường. + Thường liín kết với câc tính trạng trội hoặc siíu trội. + Mang tính ổn định vă được di truyền qua câc thế hệ.
Chỉ thị phđn tử rất đa dạng, phong phú vă được chia thănh câc nhóm như sau: + Chỉ thị dựa trín cơ sở phương phâp lai DNA hay chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism). Dựa văo câc băng DNA trín gel điện di có thể phât hiện được câc thể đồng (hoặc dị) hợp tử trội (lặn).
+ Nhóm chỉ thị phđn tử dựa trín nguyín lý khuếch đại câc gel mong muốn bằng kĩ thuật PCR ( Polymerase Chain Reaction): RAPD, SSA, AFLP…
1.4.3.2.1. Chỉ thị RFLP (Restriction Fregment Length Polymorphism)
*Nguyín lí của phương phâp RFLP
Phương phâp RFLP (Đa hình chiều dăi câc đoạn DNA cắt giới hạn) do Botstein phât minh 1980. Nguyín lý của phương phâp dựa trín câc đặc tính cơ bản sau:
- Tính chất cắt đặc trưng của câc enzyme giới hạn (Restriction enzyme - RE). - Tính chất bắt cặp tương đồng giữa câc chuỗi DNA theo nguyín tắc bổ sung.
Nguyín lí của phương phâp RFLP lă: DNA của bộ gen sau khi xử lý bằng enzyme giới hạn sẽ bị cắt thănh câc đoạn có kích thước khâc nhau. Sau khi điện di, câc đoạn năy sẽ phđn bố ở những vị trí khâc nhau trín gel, qua biến tính câc đoạn năy sẽ trở thănh những sợi đơn vă được chuyển lín măng cellulose hoặc nylon với vị trí không thay đổi. Trong quâ trình lai DNA tiếp theo trín mẫu dò (thực chất lă một đoạn DNA) sẽ bắt cặp với những đoạn có trình tự nucleotide tương đồng với nó trín măng lai - kĩ thuật lai Southerm. Khi phđn tích đa hình di truyền, sự đa dạng của câc câ thể được thực hiện qua sự khâc nhau của câc băng trín măng lai.
*Ứng dụng của RFLP: RFLP lă chỉ thị được dùng phổ biến nhất vă nhiều nhất, có thể kể ra câc ứng dụng đó lă:
- Xâc định con lai F1 trong quần thể con lai có lẫn câc câ thể tự phối. - Đânh giâ sự đa dạng di truyền của câc quần thể sinh vật.
- Xâc định câc dòng giống khâc nhau.
- Xâc định biến dị xôma. Câc biến dị năy lă do ảnh hưởng của câc đột biến không xâc định vă có thể xảy ra trong quâ trình nuôi cấy invitro .
- Thiết lập bản đồ phđn tử câc gen cần quan tđm trong quâ trình nghiín cứu [9].
1.4.3.2.2. Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) *Nguyín lý của phương phâp
AFLP (Đa hình chiều dăi câc đoạn DNA được khuếch đại chọn lọc) lă phương phâp dựa trín cơ sở của kĩ thuật PCR. Nguyín lý của phương phâp năy lă gắn câc đoạn DNA ngắn (adapter) văo 2 đầu của mạch DNA sau khi đê được cắt bằng enzyme giới hạn. Sau đó thiết kế mồi theo câc đoạn DNA ngắn đó có gắn thím một hoặc một số nucleotide vă tiến hănh phản ứng PCR.
Sản phẩm PCR được phđn tích trín gel polyacrylamit, kết quả thu được thường lă 50-100 băng DNA/1 mẫu thí nghiệm. Số lượng câc đoạn phđn tử DNA được khuếch đại phụ thuộc văo lượng C vă G có trong primer. C vă G căng nhiều câc đoạn DNA được khuếch đại căng ít. Tương tự, nếu kích thước genome căng nhỏ số đoạn phđn tử được khuếch đại căng ít.
*Ứng dụng: AFLP lă phương phâp xâc định độ đa hình cao, xđy dựng bản đồ chỉ thị DNA có hiệu quả nhất so với câc chỉ thị khâc tiết kiệm thời gian, dễ dăng lặp lại vă có thể sử dụng để phđn tích DNA từ bất kì nguồn gốc năo hay bất kì mức độ phức tạp năo.
Tuy nhiín, AFLP lă loại chỉ thị di truyền trội, giâ thănh rất đắt nín phần năo hạn chế khả năng sử dụng của nó [12].
1.4.3.2.3. Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeat)
Trong câc nghiín cứu về đa dạng di truyền, chỉ thị SSR lă một trong những chỉ thị được dùng phổ biến nhất bởi kỹ thuật đơn giản vă cho độ chính xâc cao.
SSR hay còn gọi lă vi vệ tinh, lă những đoạn trình tự DNA đơn giản lặp lại nối tiếp vă chỉ gồm 1-6 bp [69]. Tuy nhiín, tuỳ từng loăi mă số lượng câc nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại có thể thay đổi từ một đến hăng chục vă số lượng đơn vị lặp lại có thể biến động từ hai đến hăng chục lần hoặc nhiều hơn.
Chỉ thị SSR dùng để đânh giâ đa dạng di truyền, xâc lập quan hệ di truyền của cđy trồng, chọn lọc tính khâng bệnh, một số tính trạng có quan hệ chặt chẽ với năng suất ở cđy lúa, lập bản đồ, nghiín cứu locus tính trạng số lượng.
- Ưu điểm vă hạn chế của chỉ thị SSR
Thuận lợi to lớn của sự phđn tích SSR lă phương phâp năy biểu hiện số lượng lớn sự đa hình. Hơn nữa, khả năng phđn biệt câc câ thể khi có sự kết hợp câc locus được kiểm tra lăm cho phương phâp năy rất hữu dụng trong câc thí nghiệm dòng chảy gel, xâc định cđy trồng vă phđn tích mối quan hệ di truyền.
SSR được sử dụng rộng rêi vă hiệu quả trong nghiín cứu cấu trúc di truyền lúa trồng (O. Sativa), nghiín cứu quâ trình tiến hóa, lăm rõ độ thuần của vật liệu lai tạo giống..., do đđy lă chỉ thị đồng trội cho đa hình cao vă ổn định. Hiện nay, hơn 15.000 chỉ thị SSR đê được thiết lập.
SSR lă marker đồng trội, do đó dị hợp tử có thể dễ dăng được xâc định trong quâ trình thực nghiệm. Tính đồng trội của SSR sẽ gia tăng sự hiệu quả vă độ chính xâc của những phĩp tính toân di truyền quần thể dựa trín những marker năy so với những marker khâc như AFLP vă RAPD. Hơn nữa, việc xâc định dị hợp tử ở thế hệ F1 sẽ lăm cho những phđn tích phả hệ, sự lai giống, dòng chảy gel trở nín dễ dăng hơn. SSR lă công cụ hữu hiệu để chọn lọc giống, đa dạng hoâ về câc vật liệu di truyền vă dùng trong thiết lập bản đồ di truyền.
Hạn chế của kỹ thuật SSR lă quâ trình thiết kế primer quâ đắt, mỗi loại primer chỉ đặc trưng cho một loăi vă không thể âp dụng phđn tích trín một hệ thống lớn bao gồm nhiều loăi có quan hệ di truyền xa nhau.
1.4.3.2.4. Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polimorphism DNA)
Chỉ thị RAPD chạy dựa trín kỹ thuật PCR, bằng câch sử dụng những primer ngắn (khoảng 10 nucleotit) có trình tự biết trước, bắt cặp vă nhđn bản ngẫu nhiín những đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự của câc primer.
*Nguyín lý của RAPD
Nguyín lý của phương phâp lă: sử dụng một đoạn oligonucleotide có kích thước 8-12 (thông thường lă 10) nucleotide không cần biết trước trình tự lăm mồi cho phản