4. NHỮNG ĐIÍ̉M MỚI CỦA ĐÍ̀ TÀI
2.1.2. Mục tiíu cụ thể
- Thu thập được đúng mẫu bị nhiễm bệnh HXVK trín một số cđy họ Că ở câc tỉnh phía Nam.
- Phđn lập vă lăm thuần được câc chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum trín câc mẫu bệnh thu thập được.
- Xâc định được sự khâc biệt về di truyền giữa câc chủng vi khuẩn bằng kỹ thuật RAPD.
- Xâc định được độ độc tính của câc chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum trín cđy că chua.
2.2. NỘI DUNG NGHIÍN CỨU
2.2.1. Đânh giâ đa dạng di truyền của câc chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum
được thu thập tại câc tỉnh phía Nam.
- Thu thập mẫu bị nhiễm bệnh HXVK trín một số cđy họ Că ở câc tỉnh phía Nam. - Phđn lập vă lăm thuần câc chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum thu thập được. - Xâc định câc chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum bằng cặp mồi phđn tử đặc hiệu.
- Xâc định sự đa dạng di truyền của câc chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum
bằng chỉ thị phđn tử.
2.2.2. Đânh giâ độ độc tính của câc chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum được
thuthập tại câc tỉnh phía Nam.
- Thực hiện lđy nhiễm nhđn tạo câc chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum với một số giống că chua được trồng phổ biến tại câc tỉnh phía Nam để xâc định độc tính của câc chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum phđn lập được.
2.3. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VĂ PHẠM VI NGHIÍN CỨU
2.3.1. Nguồn vi khuẩn Ralstonia solanacearum
Vi khuẩn hĩo xanh được thu thập từ câc ruộng trồng că chua, khoai tđy, ớt, că dí, dưa hấu, că tím ở câc tỉnh Lđm Đồng, Quảng Ngêi, thănh phố Hồ Chí Minh, Vĩnh Long, Ninh Thuận, Cần Thơ, Tiền Giang. Địa điểm mẫu thu thập được thể hiện ở Bảng 2.1.
Bảng 2.1. Danh sâch câc mẫu vi khuẩn được thu thập ở câc tỉnh phía Nam
ST T
Ký hiệu
mẫu Địa điểm thu mẫu Tỉnh Đối tượng
1 KT1 Trung tđm nghiín cứu Rau Hoa, Phường 12
Đă Lạt (Vườn B2) Lđm Đồng Khoai tđy
2 KT2 Trung tđm nghiín cứu Rau Hoa, Phường 12
Đă Lạt (Vườn B2) Lđm Đồng Khoai tđy
3 KT3 Trung tđm nghiín cứu Rau Hoa, Phường 12
Đă Lạt (Vườn B2) Lđm Đồng Khoai tđy
4 KT4 Trung tđm nghiín cứu Rau Hoa, Phường 12
Đă Lạt (Vườn B2) Lđm Đồng Khoai tđy
5 KT5 Trung tđm nghiín cứu Rau Hoa, Phường 12
Đă Lạt (Vườn B2) Lđm Đồng Khoai tđy
6 KT6 Trung tđm nghiín cứu Rau Hoa, Phường 12
Đă Lạt (Vườn B2) Lđm Đồng Khoai tđy
7 KT7 Trung tđm nghiín cứu Rau Hoa, Phường 12
Đă Lạt (Vườn B7c) Lđm Đồng Khoai tđy
8 KT8 Trung tđm nghiín cứu Rau Hoa, Phường 12
Đă Lạt (Vườn B7c) Lđm Đồng Khoai tđy
9 KT9 Trung tđm nghiín cứu Rau Hoa, Phường 12
Đă Lạt (Vườn B7c) Lđm Đồng Khoai tđy
10 KT10 Trung tđm nghiín cứu Rau Hoa, Phường 12
Đă Lạt (Vườn B7c) Lđm Đồng Khoai tđy
11 KT11 Trung tđm nghiín cứu Rau Hoa, Phường 12
Đă Lạt (Vườn B7c) Lđm Đồng Khoai tđy
12 KT12 Trung tđm nghiín cứu Rau Hoa, Phường 12
Đă Lạt (Vườn B7c) Lđm Đồng Că chua
13 C13 Phường 8, Tp. Đă Lạt Lđm Đồng Că chua
14 C14 Phường 8, Tp. Đă Lạt Lđm Đồng Că chua
15 C15 Phường 8, Tp. Đă Lạt Lđm Đồng Că chua
16 C16 Phường 8, Tp. Đă Lạt Lđm Đồng Că chua
17 C17 Phường 8, Tp. Đă Lạt Lđm Đồng Că chua
18 C18 Thôn Tđn An, xê Hiệp An, huyện Đức Trọng,
Lđm Đồng Lđm Đồng Că chua
19 C19 Thôn Tđn An, xê Hiệp An, huyện Đức Trọng,
Lđm Đồng Lđm Đồng Că chua
20 C20 Thôn Tđn An, xê Hiệp An, huyện Đức Trọng,
21 O21 Xê Hiệp An, Đức Trọng, Lđm Đồng Lđm Đồng Ớt 22 O22 Xê Hiệp An, Đức Trọng, Lđm Đồng Lđm Đồng Ớt 23 O23 Xê Hiệp An, Đức Trọng, Lđm Đồng Lđm Đồng Ớt 24 O24 Xê Hiệp Trung, Đức Trọng, Lđm Đồng Lđm Đồng Ớt 25 C25 Thôn 1, xê Đạ Ròn, huyện Đơn Dương Lđm Đồng Că chua 26 C26 Hộ Khiím Nhi, thôn 1, xê Đạ Ròn, huyện
Đơn Dương Lđm Đồng Că chua
27 C27 Hộ Khiím Nhi, thôn 1, xê Đạ Ròn, huyện
Đơn Dương Lđm Đồng Că chua
28 C28 Thôn Suối thông B1, xê Đạ Ròn, huyện Đơn
Dương Lđm Đồng Că chua
29 C29 Thôn Suối thông B1, xê Đạ Ròn, huyện Đơn
Dương Lđm Đồng Că chua
30 C30 Thôn Suối thông B1, xê Đạ Ròn, huyện Đơn
Dương Lđm Đồng Că chua
31 O31 Đ́p Trung Viết, xê Phước Hiệp, huyện Củ Chi Thănh phố
Hồ Chí Minh Ớt 32 O32A Đ́p Trung Viết, xê Phước Hiệp, huyện Củ Chi Thănh phố
Hồ Chí Minh Ớt 33 O33A Đ́p Trung Viết, xê Phước Hiệp, huyện Củ Chi Thănh phố
Hồ Chí Minh Ớt 34 O34A Đ́p Trung Viết, xê Phước Hiệp, huyện Củ Chi Thănh phố
Hồ Chí Minh Ớt 35 O35A Đ́p Trung Viết, xê Phước Hiệp, huyện Củ Chi Thănh phố
Hồ Chí Minh Ớt 36 O36A Đ́p Trung Viết, xê Phước Hiệp, huyện Củ Chi Thănh phố
Hồ Chí Minh Ớt 37 O37B Đ́p Trung Viết, xê Phước Hiệp, huyện Củ Chi Thănh phố
Hồ Chí Minh Ớt 38 O38B Đ́p Trung Viết, xê Phước Hiệp, huyện Củ Chi Thănh phố
Hồ Chí Minh Ớt 39 O39B Đ́p Trung Viết, xê Phước Hiệp, huyện Củ Chi Thănh phố
Hồ Chí Minh Ớt 40 O40B Đ́p Trung Viết, xê Phước Hiệp, huyện Củ Chi Thănh phố
Hồ Chí Minh Ớt 41 O41 Đ́p Trung Viết, xê Phước Hiệp, huyện Củ Chi Thănh phố
Hồ Chí Minh Ớt 42 O42 Đ́p Trung Viết, xê Phước Hiệp, huyện Củ Chi Thănh phố
Hồ Chí Minh Ớt 43 O43 Đ́p Xóm Đồng, xê Tđn Phú Trung, huyện Củ
Chi
Thănh phố
Hồ Chí Minh Ớt 44 O44 Đ́p Xóm Đồng, xê Tđn Phú Trung, huyện Củ
Chi
Thănh phố
Hồ Chí Minh Ớt 45 L45 Đ́p Xóm Đồng, xê Tđn Phú Trung, huyện Củ
Chi
Thănh phố
46 L46 Đ́p Xóm Đồng, xê Tđn Phú Trung, huyện Củ Chi
Thănh phố
Hồ Chí Minh Lạc dại 47 CD47 Xê Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi Thănh phố
Hồ Chí Minh Că dí 48 CD48 Xê Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi Thănh phố
Hồ Chí Minh Că dí 49 CD49 Xê Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi Thănh phố
Hồ Chí Minh Că dí 50 CD50 Xê Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi Thănh phố
Hồ Chí Minh Că dí 51 O51 Xê An Thạnh Thủy, huyện Chợ Gạo Tiền Giang Ớt 52 O52 Xê Bình Ninh, huyện Chợ Gạo Tiền Giang Ớt 53 O53 Xê Bình Ninh, huyện Chợ Gạo Tiền Giang Ớt 54 O54 Xê Bình Ninh, huyện Chợ Gạo Tiền Giang Ớt 55 O55 Xê Thănh Lợi, huyện Bình Tđn, Vĩnh Long Vĩnh Long Ớt 56 O56 Xê Thănh Lợi, huyện Bình Tđn, Vĩnh Long Vĩnh Long Ớt 57 O57 Thănh Nhơn, xê Thănh Lợi, huyện Bình Tđn,
Vĩnh Long Vĩnh Long Ớt
58 O58 Thănh Nhơn, xê Thănh Lợi, huyện Bình Tđn,
Vĩnh Long Vĩnh Long Ớt
59 O59 Thănh Nhơn, xê Thănh Lợi, huyện Bình Tđn,
Vĩnh Long Vĩnh Long Ớt
60 CD60 Khu vực Tđn Thạnh, phường Trường Lạc,
quận Ô Môn Cần Thơ Că dí
61 CD61 Khu vực Tđn Thạnh, phường Trường Lạc,
quận Ô Môn Cần Thơ Că dí
62 CD62 Khu vực Tđn Thạnh, phường Trường Lạc,
quận Ô Môn Cần Thơ Că dí
63 CD63 Khu vực Tđn Thạnh, phường Trường Lạc,
quận Ô Môn Cần Thơ Că dí
64 DH64 Khu vực Tđn Thạnh, phường Trường Lạc,
quận Ô Môn Cần Thơ Dưa hấu
65 DH65 Khu vực Tđn Thạnh, phường Trường Lạc,
quận Ô Môn Cần Thơ Dưa hấu
66 DH66 Khu vực Tđn Thạnh, phường Trường Lạc,
quận Ô Môn Cần Thơ Dưa hấu
67 DH67 Khu vực Tđn Thạnh, phường Trường Lạc,
quận Ô Môn Cần Thơ Dưa hấu
68 DH68 Khu vực Tđn Thạnh, phường Trường Lạc,
quận Ô Môn Cần Thơ Dưa hấu
69 DH69 Khu vực Tđn Thạnh, phường Trường Lạc,
quận Ô Môn Cần Thơ Dưa hấu
70 DH70 Khu vực Tđn Thạnh, phường Trường Lạc,
71 DH71 Khu vực Tđn Thạnh, phường Trường Lạc,
quận Ô Môn Cần Thơ Dưa hấu
72 DH72 Khu vực Tđn Thạnh, phường Trường Lạc,
quận Ô Môn Cần Thơ Dưa hấu
73 O73 Thơm Rơm, phường Tđn Hưng, quận Thốt
Nốt Cần Thơ Ớt
74 O74 Thơm Rơm, phường Tđn Hưng, quận Thốt
Nốt Cần Thơ Ớt
75 O75 Thơm Rơm, phường Tđn Hưng, quận Thốt
Nốt Cần Thơ Ớt
76 O76 Thơm Rơm, phường Tđn Hưng, quận Thốt
Nốt Cần Thơ Ớt
77 O77 Thơm Rơm, phường Tđn Hưng, quận Thốt
Nốt Cần Thơ Ớt
78 O78 Thơm Rơm, phường Tđn Hưng, quận Thốt
Nốt Cần Thơ Ớt
79 O79 Thơm Rơm, phường Tđn Hưng, quận Thốt
Nốt Cần Thơ Ớt
80 O80 Phường Trung Kiín, quận Thốt Nốt Cần Thơ Ớt 81 O81 Phường Trung Kiín, quận Thốt Nốt Cần Thơ Ớt 82 O82 Khu vực Phúc Lộc 3, phường Thạnh Hòa,
quận Thốt Nốt Cần Thơ Ớt
83 O83 Khu vực Phúc Lộc 3, phường Thạnh Hòa,
quận Thốt Nốt Cần Thơ Ớt
84 O84 Khu vực Phúc Lộc 3, phường Thạnh Hòa,
quận Thốt Nốt Cần Thơ Ớt
85 O85 Khu vực Phúc Lộc 3, phường Thạnh Hòa,
quận Thốt Nốt Cần Thơ Ớt
86 O86 Thuận Bắc, Tp. Phan Rang, Ninh Thuận Ninh Thuận Ớt 87 O87 Thuận Bắc, Tp. Phan Rang, Ninh Thuận Ninh Thuận Ớt 88 O88 Thuận Bắc, Tp. Phan Rang, Ninh Thuận Ninh Thuận Ớt
89 O89 Mộ Đức ( Quảng Ngêi) Quảng Ngêi Ớt
90 O90 Mộ Đức ( Quảng Ngêi) Quảng Ngêi Ớt
91 O91 Mộ Đức ( Quảng Ngêi) Quảng Ngêi Ớt
92 O92 Mộ Đức (Quảng Ngêi) Quảng Ngêi Ớt
2.3.2. Giống că chua
Thí nghiệm xâc định độc tính của vi khuẩn được thực hiện trín 3 giống că chua:
Bảng 2.2. Câc giống că chua chuẩn bị cho thí nghiệm lđy nhiễm
Giống Nguồn gốc
TN52 Viện KHKT NN miền Nam
West Virginia 700 (W700) Trung tđm rau thế giới (AVRDC, chuẩn nhiễm) Haiwaii 7996 (H7996) Trung tđm rau thế giới (AVRDC, chuẩn khâng)
2.3.3. Môi trường nhđn tạo
Thí nghiệm sử dụng một số môi trường nhđn tạo dùng để phđn ly, nuôi cấy vi khuẩn.
Bảng 2.3. Một số môi trường nhđn tạo chuẩn bị cho phđn lập vi khuẩn
Môi trường Hóa chất Thănh phần
TTC (Kelman, 1954) [63] Glucose 5g Peptone 10g Casein hydrolysate 1g Agar 15g Nước cất 1L Khử trùng ở 0,5at, 121oC, 20 phút, lăm lạnh đến hấp nóng bằng mây rồi lăm lạnh đến 65oC vă thím 5ml 2,3,5 triphenyl tetrazolium chloride 1%)
523 (Kado, 1970) [60] Sucrose 10g Casein hydrolysate 8g Yeast extract 4g K2HPO4 2g MgSO4.7H2O 0.3g Agar 15g Nước cất 1L
2.3.4. Vật liệu nghiín cứu
2.3.4.1. Cặp mồi đặc hiệu
Sử dụng cặp mồi AU.P759/760 (Opina, N et al, 1997) [78] đặc hiệu cho loăi vi khuẩn Ralstonia solanacearum.
AU P.759: 5’GTCGCCGTCAGCAATCCGGAATCG 3’ AU P.760: 5’GTCGCCGTCAGCAATGGAATCG 3’
2.3.4.2. Bộ mồi RAPD
100 mồi RAPD (Biosience) được sử dụng để đânh giâ kiểu gen của 3 chủng vi khuẩn đại diện được thu thập. Trình tự câc mồi được biểu hiện ở Bảng 2.4
Bảng 2.4. Bộ mồi RAPD biểu hiện đa hình
STT Tín mồi Trình tự mồi STT Tín mồi Trình tự mồi
1 UBC#301 CGGTGGCGAA 51 UBC#351 CTCCCGGTGG
2 UBC#302 CGGCCCACGT 52 UBC#352 CACAACGGGT
3 UBC#303 GCGGGAGACC 53 UBC#353 TGGGCTCGCT
4 UBC#304 AGTCCTCGCC 54 UBC#354 CTAGAGGCCG
5 UBC#305 GCTGGTACCC 55 UBC#355 GTATGGGGCT
6 UBC#306 GTCCTCGTAG 56 UBC#356 GCGGCCCTCT
7 UBC#307 CGCATTTGCA 57 UBC#357 AGGCCAAATG
8 UBC#308 AGCGGCTAGG 58 UBC#358 GGTCAGGCCC
9 UBC#309 ACATCCTGCG 59 UBC#359 AGGCAGACCT
10 UBC#310 GAGCCAGAAG 60 UBC#360 CTCTCCAGGC
11 UBC#311 GGTAACCGTA 61 UBC#361 GCGAGGTGCT
12 UBC#312 ACGGCGTCAC 62 UBC#362 CCGCCTTACA
13 UBC#313 ACGGCAGTGG 63 UBC#363 ATGACGTTGA
14 UBC#314 ACTTCCTCCA 64 UBC#364 GGCTCTCGCG
15 UBC#315 GGTCTCCTAG 65 UBC#365 TAGACAGAGG
16 UBC#316 CCTCACCTGT 66 UBC#366 CCTGATTGCC
17 UBC#317 CTAGGGGCTG 67 UBC#367 ACCTTTGGCT
18 UBC#318 CGGAGAGCGA 68 UBC#368 ACTTGTGCGG
19 UBC#319 GTGGCCGCGC 69 UBC#369 GCGCATAGCA
20 UBC#320 CCGGCATAGA 70 UBC#370 TCAGCCAGCG
22 UBC#322 GCCGCTACTA 72 UBC#372 CCCACTGACG
23 UBC#323 GACATCTCGC 73 UBC#373 CTGAGGAGTG
24 UBC#324 ACAGGGAACG 74 UBC#374 GGTCAACCCT
25 UBC#325 TCTAAGCTCG 75 UBC#375 CCGGACACGA
26 UBC#326 CGGATCTCTA 76 UBC#376 CAGGACATCG
27 UBC#327 ATACGGCGTC 77 UBC#377 GACGGAAGAG
28 UBC#328 ATGGCCTTAC 78 UBC#378 GACAACAGGA
29 UBC#329 GCGAACCTCC 79 UBC#379 GGGCTAGGGT
30 UBC#330 GGTGGTTTCC 80 UBC#380 AGGAGTGAGA
31 UBC#331 GCCTAGTCAC 81 UBC#381 ATGAGTCCTG
32 UBC#332 AACGCGTAGA 82 UBC#382 ATACACCAGC
33 UBC#333 GAATGCGACG 83 UBC#383 GAGGCGCTGC
34 UBC#334 ATGGCAAAGC 84 UBC#384 TGCGCCGCTA
35 UBC#335 TGGACCACCC 85 UBC#385 ACCGGGAACG
36 UBC#336 GCCACGGAGA 86 UBC#386 TGTAAGCTCG
37 UBC#337 TCCCGAACCG 87 UBC#387 CGCTGTCGCC
38 UBC#338 CTGTGGCGGT 88 UBC#388 CGGTCGCGTC
39 UBC#339 CTCACTTGGG 89 UBC#389 CGCCCGCAGT
40 UBC#340 GAGAGGCACC 90 UBC#390 TCACTCAGAG
41 UBC#341 CTGGGGCCGT 91 UBC#391 GCGAACCTCG
42 UBC#342 GAGATCCCTC 92 UBC#392 CCTGGTGGTT
43 UBC#343 TGTTAGGCTC 93 UBC#393 TTCCATGCCT
44 UBC#344 TGTTAGGCAC 94 UBC#394 TCACGCAGTT
45 UBC#345 GCGTGACCCG 95 UBC#395 TCACTTGAGG
46 UBC#346 TAGGCGAACG 96 UBC#396 GAATGCGAGG
47 UBC#347 TTGCTTGGCG 97 UBC#397 GGGCTGTGCC
48 UBC#348 CACGGCTGCG 98 UBC#398 CAGTGCTCTT
49 UBC#349 GGAGCCCCCT 99 UBC#399 TTGCTGGGCG
2.3.4.3. Hóa chất, dụng cụ
Hóa chất: câc chất sử dụng trong phản ứng PCR: Taq DNA polymerase, dNTP, MgCl2, chất nhuộm DNA chứa SYBR green, TBE.
Dụng cụ: mây chạy PCR, mây điện di, mây ly tđm, mây votex,... vă một số câc trang thiết bị thiết yếu phục vụ cho nghiín cứu.
2.4. PHẠM VI NGHIÍN CỨU
- Địa điểm thu thập mẫu nhiễm bệnh HXVK: 7 tỉnh miền Nam: Lđm Đồng, Ninh Thuận, thănh phố Hồ Chí Minh, Tiền Giang, Vĩnh Long, Cần Thơ, Quảng Ngêi.
- Địa điểm nghiín cứu: tại phòng thí nghiệm Bệnh cđy, nhă lưới của Bộ môn Bảo vệ thực vật vă phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học, khoa Nông học, trường Đại học Nông Lđm Huế.
- Thời gian: Đề tăi được thực hiện từ 5/2014 đến 6/2015.
2.5. PHƯƠNG PHÂP NGHIÍN CỨU 2.5.1. Phương phâp thu mẫu bệnh
Phương phâp thu mẫu cđy bệnh của Rogeret (2005) [82]: Thu mẫu ở những cđy mới bị bệnh. Mỗi ruộng thu 2÷5 cđy, giữ trong túi polyetilen. Những cđy lớn có thể cắt một đoạn thđn sât gốc có kích thước 30 cm. Ghi thời gian thu mẫu (ngăy, thâng, năm), địa điểm, giống cđy…Sau mỗi lần cắt, dụng cụ cắt phải được tẩy trùng bằng cồn 75o
để trânh lđy lan mầm bệnh giữa câc mẫu với nhau.
2.5.2. Phương phâp phđn lập vi khuẩn Ralstonia solanacearum
+ Phương phâp xử lý mẫu: Sau khi được rửa sạch bằng nước mây vă sât trùng bề mặt bằng cồn 75o, câc mẫu bệnh được cắt ngang một đoạn ở phần cuối gốc thđn vă ngđm trong ống nghiệm chứa 25 ml nước cất vô trùng, để ở nhiệt độ phòng. Sau 5 ÷ 10 phút có thể quan sât thấy một dòng dịch vi khuẩn mău trắng sữa chảy ra từ mẫu bệnh. Sau 20 phút loại bỏ đoạn thđn nhiễm bệnh ra khỏi ống chứa dịch vi khuẩn vă chia nhỏ thănh ra 3 ống eppendorf mới. Những ống dịch năy được bảo quản ở nhiệt độ 27oC, 4oC vă -10oC.
+ Phđn lập vă lăm thuần câc chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum: pha loêng dịch vi khuẩn ở câc nồng độ khâc nhau 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 để cấy gạt trín môi trường TTC [63] nhằm thu được câc khuẩn lạc riíng biệt. Mẫu sau khi cấy gạt được nuôi giữ trong tủ định ôn ở nhiệt độ 28oC ± 2oC.
Theo dõi vă ghi kết quả sau 48-72 giờ. Từ mỗi nhóm hình thâi khuẩn lạc tiến hănh chọn 3 đến 5 khuẩn lạc tiếp tục cấy gạt trín môi trường TTC để lăm thuần vi khuẩn. Mẫu sau khi cấy gạt được nuôi giữ trong tủ định ôn ở nhiệt độ 28oC ± 2oC.
Theo dõi kết quả sau 48-72 giờ. Tiếp tục từ mỗi nhóm khuẩn lạc đặc trưng riíng rẽ, chọn 3 đến 5 khuẩn lạc lưu giữ trong 0,2 ml nước cất vô trùng cho mỗi ống eppendorf 1,5 ml bảo quản ở nhiệt độ phòng vă 4oC. Chọn tiếp 3 đến 5 khuẩn lạc khâc
lưu giữ trong 0,2 ml glyxerol 30% cho mỗi ống eppendorf 1,5 ml bảo quản ở nhiệt độ - 10oC nhằm lưu giữ mẫu cho câc thí nghiệm sau.
+ Phương phâp xâc định vi khuẩn Ralstonia solanacearum bằng kỹ thuật PCR: sử dụng cặp mồi AU.P759/760 [78] đặc hiệu cho loăi vi khuẩn Ralstonia solanacearum.
Mỗi phản ứng sẽ lă 25 µl, trong đó gồm nước cất vô trùng: 12,8 µl; 5X buffer: 5 µl; primer: 1 µl/primer; Taq polymerase: 0,2 µl vă DNA: 5 µl.
Khuếch đại PCR theo chu trình nhiệt: bước 1 gồm 1 chu kỳ ở 94 oC trong 3 phút, 53 oC trong 1 phút, 72 oC trong 1.5 phút; bước 2 gồm 30 chu kỳ ở 94 oC trong 0.3 phút, 60 oC trong 0.3 phút, 72 oC trong 0.3 phút; bước 3 gồm 1 chu kỳ ở 72 oC trong 5 phút vă cuối cùng ủ ở 4 oC.
Sản phẩm PCR sau đó thím 5 µl chất nhuộm chứa SYBR Green, ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 20 phút. Sau đó đem điện di trín agarose gel 1% trong dung dịch TBE 0,5X.
Sản phẩm điện di được soi trín đỉn UV vă chụp ảnh.
2.5.3. Phương phâp tâch chiết DNA
Thực hiện theo phương phâp của Chen vă Kuo (1993) [44]: Câc đĩa cấy chuyền lăm thuần vi khuẩn, sau khi lấy khuẩn lạc để lưu giữ, tiếp tục lấy thím 4-5 khuẩn lạc