4. NHỮNG ĐIÍ̉M MỚI CỦA ĐÍ̀ TÀI
2.3.4. Vật liệu nghiín cứu
2.3.4.1. Cặp mồi đặc hiệu
Sử dụng cặp mồi AU.P759/760 (Opina, N et al, 1997) [78] đặc hiệu cho loăi vi khuẩn Ralstonia solanacearum.
AU P.759: 5’GTCGCCGTCAGCAATCCGGAATCG 3’ AU P.760: 5’GTCGCCGTCAGCAATGGAATCG 3’
2.3.4.2. Bộ mồi RAPD
100 mồi RAPD (Biosience) được sử dụng để đânh giâ kiểu gen của 3 chủng vi khuẩn đại diện được thu thập. Trình tự câc mồi được biểu hiện ở Bảng 2.4
Bảng 2.4. Bộ mồi RAPD biểu hiện đa hình
STT Tín mồi Trình tự mồi STT Tín mồi Trình tự mồi
1 UBC#301 CGGTGGCGAA 51 UBC#351 CTCCCGGTGG
2 UBC#302 CGGCCCACGT 52 UBC#352 CACAACGGGT
3 UBC#303 GCGGGAGACC 53 UBC#353 TGGGCTCGCT
4 UBC#304 AGTCCTCGCC 54 UBC#354 CTAGAGGCCG
5 UBC#305 GCTGGTACCC 55 UBC#355 GTATGGGGCT
6 UBC#306 GTCCTCGTAG 56 UBC#356 GCGGCCCTCT
7 UBC#307 CGCATTTGCA 57 UBC#357 AGGCCAAATG
8 UBC#308 AGCGGCTAGG 58 UBC#358 GGTCAGGCCC
9 UBC#309 ACATCCTGCG 59 UBC#359 AGGCAGACCT
10 UBC#310 GAGCCAGAAG 60 UBC#360 CTCTCCAGGC
11 UBC#311 GGTAACCGTA 61 UBC#361 GCGAGGTGCT
12 UBC#312 ACGGCGTCAC 62 UBC#362 CCGCCTTACA
13 UBC#313 ACGGCAGTGG 63 UBC#363 ATGACGTTGA
14 UBC#314 ACTTCCTCCA 64 UBC#364 GGCTCTCGCG
15 UBC#315 GGTCTCCTAG 65 UBC#365 TAGACAGAGG
16 UBC#316 CCTCACCTGT 66 UBC#366 CCTGATTGCC
17 UBC#317 CTAGGGGCTG 67 UBC#367 ACCTTTGGCT
18 UBC#318 CGGAGAGCGA 68 UBC#368 ACTTGTGCGG
19 UBC#319 GTGGCCGCGC 69 UBC#369 GCGCATAGCA
20 UBC#320 CCGGCATAGA 70 UBC#370 TCAGCCAGCG
22 UBC#322 GCCGCTACTA 72 UBC#372 CCCACTGACG
23 UBC#323 GACATCTCGC 73 UBC#373 CTGAGGAGTG
24 UBC#324 ACAGGGAACG 74 UBC#374 GGTCAACCCT
25 UBC#325 TCTAAGCTCG 75 UBC#375 CCGGACACGA
26 UBC#326 CGGATCTCTA 76 UBC#376 CAGGACATCG
27 UBC#327 ATACGGCGTC 77 UBC#377 GACGGAAGAG
28 UBC#328 ATGGCCTTAC 78 UBC#378 GACAACAGGA
29 UBC#329 GCGAACCTCC 79 UBC#379 GGGCTAGGGT
30 UBC#330 GGTGGTTTCC 80 UBC#380 AGGAGTGAGA
31 UBC#331 GCCTAGTCAC 81 UBC#381 ATGAGTCCTG
32 UBC#332 AACGCGTAGA 82 UBC#382 ATACACCAGC
33 UBC#333 GAATGCGACG 83 UBC#383 GAGGCGCTGC
34 UBC#334 ATGGCAAAGC 84 UBC#384 TGCGCCGCTA
35 UBC#335 TGGACCACCC 85 UBC#385 ACCGGGAACG
36 UBC#336 GCCACGGAGA 86 UBC#386 TGTAAGCTCG
37 UBC#337 TCCCGAACCG 87 UBC#387 CGCTGTCGCC
38 UBC#338 CTGTGGCGGT 88 UBC#388 CGGTCGCGTC
39 UBC#339 CTCACTTGGG 89 UBC#389 CGCCCGCAGT
40 UBC#340 GAGAGGCACC 90 UBC#390 TCACTCAGAG
41 UBC#341 CTGGGGCCGT 91 UBC#391 GCGAACCTCG
42 UBC#342 GAGATCCCTC 92 UBC#392 CCTGGTGGTT
43 UBC#343 TGTTAGGCTC 93 UBC#393 TTCCATGCCT
44 UBC#344 TGTTAGGCAC 94 UBC#394 TCACGCAGTT
45 UBC#345 GCGTGACCCG 95 UBC#395 TCACTTGAGG
46 UBC#346 TAGGCGAACG 96 UBC#396 GAATGCGAGG
47 UBC#347 TTGCTTGGCG 97 UBC#397 GGGCTGTGCC
48 UBC#348 CACGGCTGCG 98 UBC#398 CAGTGCTCTT
49 UBC#349 GGAGCCCCCT 99 UBC#399 TTGCTGGGCG
2.3.4.3. Hóa chất, dụng cụ
Hóa chất: câc chất sử dụng trong phản ứng PCR: Taq DNA polymerase, dNTP, MgCl2, chất nhuộm DNA chứa SYBR green, TBE.
Dụng cụ: mây chạy PCR, mây điện di, mây ly tđm, mây votex,... vă một số câc trang thiết bị thiết yếu phục vụ cho nghiín cứu.
2.4. PHẠM VI NGHIÍN CỨU
- Địa điểm thu thập mẫu nhiễm bệnh HXVK: 7 tỉnh miền Nam: Lđm Đồng, Ninh Thuận, thănh phố Hồ Chí Minh, Tiền Giang, Vĩnh Long, Cần Thơ, Quảng Ngêi.
- Địa điểm nghiín cứu: tại phòng thí nghiệm Bệnh cđy, nhă lưới của Bộ môn Bảo vệ thực vật vă phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học, khoa Nông học, trường Đại học Nông Lđm Huế.
- Thời gian: Đề tăi được thực hiện từ 5/2014 đến 6/2015.
2.5. PHƯƠNG PHÂP NGHIÍN CỨU 2.5.1. Phương phâp thu mẫu bệnh
Phương phâp thu mẫu cđy bệnh của Rogeret (2005) [82]: Thu mẫu ở những cđy mới bị bệnh. Mỗi ruộng thu 2÷5 cđy, giữ trong túi polyetilen. Những cđy lớn có thể cắt một đoạn thđn sât gốc có kích thước 30 cm. Ghi thời gian thu mẫu (ngăy, thâng, năm), địa điểm, giống cđy…Sau mỗi lần cắt, dụng cụ cắt phải được tẩy trùng bằng cồn 75o
để trânh lđy lan mầm bệnh giữa câc mẫu với nhau.
2.5.2. Phương phâp phđn lập vi khuẩn Ralstonia solanacearum
+ Phương phâp xử lý mẫu: Sau khi được rửa sạch bằng nước mây vă sât trùng bề mặt bằng cồn 75o, câc mẫu bệnh được cắt ngang một đoạn ở phần cuối gốc thđn vă ngđm trong ống nghiệm chứa 25 ml nước cất vô trùng, để ở nhiệt độ phòng. Sau 5 ÷ 10 phút có thể quan sât thấy một dòng dịch vi khuẩn mău trắng sữa chảy ra từ mẫu bệnh. Sau 20 phút loại bỏ đoạn thđn nhiễm bệnh ra khỏi ống chứa dịch vi khuẩn vă chia nhỏ thănh ra 3 ống eppendorf mới. Những ống dịch năy được bảo quản ở nhiệt độ 27oC, 4oC vă -10oC.
+ Phđn lập vă lăm thuần câc chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum: pha loêng dịch vi khuẩn ở câc nồng độ khâc nhau 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 để cấy gạt trín môi trường TTC [63] nhằm thu được câc khuẩn lạc riíng biệt. Mẫu sau khi cấy gạt được nuôi giữ trong tủ định ôn ở nhiệt độ 28oC ± 2oC.
Theo dõi vă ghi kết quả sau 48-72 giờ. Từ mỗi nhóm hình thâi khuẩn lạc tiến hănh chọn 3 đến 5 khuẩn lạc tiếp tục cấy gạt trín môi trường TTC để lăm thuần vi khuẩn. Mẫu sau khi cấy gạt được nuôi giữ trong tủ định ôn ở nhiệt độ 28oC ± 2oC.
Theo dõi kết quả sau 48-72 giờ. Tiếp tục từ mỗi nhóm khuẩn lạc đặc trưng riíng rẽ, chọn 3 đến 5 khuẩn lạc lưu giữ trong 0,2 ml nước cất vô trùng cho mỗi ống eppendorf 1,5 ml bảo quản ở nhiệt độ phòng vă 4oC. Chọn tiếp 3 đến 5 khuẩn lạc khâc
lưu giữ trong 0,2 ml glyxerol 30% cho mỗi ống eppendorf 1,5 ml bảo quản ở nhiệt độ - 10oC nhằm lưu giữ mẫu cho câc thí nghiệm sau.
+ Phương phâp xâc định vi khuẩn Ralstonia solanacearum bằng kỹ thuật PCR: sử dụng cặp mồi AU.P759/760 [78] đặc hiệu cho loăi vi khuẩn Ralstonia solanacearum.
Mỗi phản ứng sẽ lă 25 µl, trong đó gồm nước cất vô trùng: 12,8 µl; 5X buffer: 5 µl; primer: 1 µl/primer; Taq polymerase: 0,2 µl vă DNA: 5 µl.
Khuếch đại PCR theo chu trình nhiệt: bước 1 gồm 1 chu kỳ ở 94 oC trong 3 phút, 53 oC trong 1 phút, 72 oC trong 1.5 phút; bước 2 gồm 30 chu kỳ ở 94 oC trong 0.3 phút, 60 oC trong 0.3 phút, 72 oC trong 0.3 phút; bước 3 gồm 1 chu kỳ ở 72 oC trong 5 phút vă cuối cùng ủ ở 4 oC.
Sản phẩm PCR sau đó thím 5 µl chất nhuộm chứa SYBR Green, ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 20 phút. Sau đó đem điện di trín agarose gel 1% trong dung dịch TBE 0,5X.
Sản phẩm điện di được soi trín đỉn UV vă chụp ảnh.
2.5.3. Phương phâp tâch chiết DNA
Thực hiện theo phương phâp của Chen vă Kuo (1993) [44]: Câc đĩa cấy chuyền lăm thuần vi khuẩn, sau khi lấy khuẩn lạc để lưu giữ, tiếp tục lấy thím 4-5 khuẩn lạc cho văo 4 ống eppendorf mới. Mỗi ống chứa 50ml TE buffer.
Đun sôi câch thủy dung dịch TE chứa khuẩn lạc của vi khuẩn trong 10 phút, sau đó ly tđm ở 12000 vòng 4oC trong 10 phút.
Sau khi ly tđm, chuyển phần dung dịch phía trín sang một ống eppendorf mới, phần cặn loại bỏ.
DNA sau khi tâch chiết sẽ được kiểm tra bằng phương phâp điện di trín agarose gel 1% trong dung dịch TBE 0,5X.
Sản phẩm điện di được soi trín đỉn UV vă chụp ảnh.
2.5.4. Phương phâp xâc định phylotype của vi khuẩn Ralstonia solanacearum
Sử dụng bộ mồi phylotype (Bảng 2.5) đặc hiệu để tiến hănh xâc định phylotype của câc chủng phđn lập được.
Bảng 2.5. Bộ mồi xâc định phylotype của vi khuẩn Ralstonia solanacearum
Tín mồi Trình tự mồi Kích thước băng DNA
Nmult: 21: 1F CGTTGATGAGGCGCGCAATTT 144 bp
Nmult: 21: 2F AAGTTATGGACGGTGGAAGTC 372 bp
Nmult: 22: InF ATTGCCAAGACGAGAGAAGTA 213 bp
Nmult: 23: AF ATTACGAGAGCAATCGAAAGATT 91 bp
Nmult: 22: RR TCGCTTGACCCTATAACGAGTA
759 GTCGCCGTCAACTCACTTTCC
280 bp
Mỗi phản ứng sẽ lă 25 µl, trong đó bao gồm: 5X buffer: 5 µl; MgCl2: 2 µl; dNTP: 0,5 µl; Mix primer: 2,5 µl; Taq-polymerase: 0,2 µl vă DNA: 14,8 µl.
Khuếch đại PCR theo chu kỳ nhiệt: bước 1 gồm 1 chu kỳ ở 96 oC trong 10 phút; bước 2 gồm 30 chu kỳ: 94 oC ở 0,5 phút, 59 oC ở 1,5 phút, 72 oC ở 1,5 phút; bước 3 gồm 1 chu kì ở 72 oC trong 20 phút vă cuối cùng ủ ở 11 oC.
Sản phẩm PCR sau đó thím 5 µl chất nhuộm chứa SYBR Green, ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 20 phút. Sau đó đem điện di trín agarose gel 2% trong dung dịch TBE 0,5X.
Sản phẩm điện di được soi trín đỉn UV vă chụp ảnh.
2.5.5. Phương phâp đânh giâ đa dạng di truyền vi khuẩn Ralstonia solanacearum
Sử dụng bộ mồi RAPD (100 cặp mồi) để tiến hănh kỹ thuật đa hình RAPD. Mỗi phản ứng sẽ lă 15 µl, trong đó bao gồm: nước cất vô trùng: 4,3 µl, 5X buffer: 3 µl; MgCl2 (25Mm): 1 µl; dNTP (10Mm): 0,5 µl; primer: 1 µl; Taq polymerase: 0,2 µl vă DNA: 5 µl.
Khuyếch đại PCR theo chu kì nhiệt: bước 1 gồm 1 chu kỳ ở 94oC trong 3 phút; bước 2 gồm 40 chu kỳ: 94oC trong 1phút, 37oC trong 1 phút, 72oC trong 2 phút; bước 3 gồm 1 chu kỳ ở 72oC trong 7 phút vă cuối cùng ủ ở 4oC.
Sản phẩm PCR sau đó thím 5 µl chất nhuộm chứa SYBR Green, ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 20 phút. Sau đó đem điện di trín agarose gel 1% trong dung dịch TBE 0,5X.
Sản phẩm điện di được soi trín đỉn UV vă chụp ảnh.
* Câc chỉ tiíu theo dõi
- Số băng được khuếch đại ở mỗi chủng của mỗi chỉ thị đa hình RAPD. - Tổng số băng đếm được của mỗi chủng với câc chỉ thị đa hình RAPD. - Số băng biểu hiện đa hình của mỗi chủng với câc chỉ thị đa hình RAPD. - Tổng số băng đa hình biểu hiện đa hình của mỗi chủng.
- Tỷ lệ băng đa hình của mỗi chủng (%).
Số liệu RAPD được ghi nhận dựa văo thang chuẩn 100bp. Tiíu chuẩn hóa sản phẩm RAPD theo quy ước: “1” xuất hiện phđn đoạn DNA, “0” không xuất hiện phđn đoạn DNA. Câc số liệu năy sẽ được đưa văo chương trình NTSYS – pc để tính ma trận tương đồng giữa câc đôi mẫu. Việc tính toân ma trận tương đồng dựa trín công thức:
Jij = a/(n-d)
Trong đó: a: lă số băng DNA có cả ở 2 giống i vă j
d: lă số băng DNA không có trong cả 2 giống I vă J. n: lă tổng số băng DNA thu được của 2 giống
Sau đó câc mẫu thí nghiệm được xử lý tiếp trong phần mềm Treecon để xâc định hệ số tương đồng di truyền vă cuối cùng được biểu hiện trín biểu đồ quan hệ di truyền.
2.5.6. Phương phâp lđy nhiễm nhđn tạo
2.5.6.1. Câch thực hiện
Gieo hạt 3 giống că chua văo câc cốc nhựa có đường kính 5,7 cm (Bảng 2.2), đến lúc că chua được 4-5 lâ thì tiến hănh lđy nhiễm nhđn tạo với một số chủng vi khuẩn
Ralstonia solanacearum đê phđn lập được.
Cụ thể: sau khi gieo 30 ngăy (4-5 lâ thật) cđy trong cốc được gđy xât thương phần rễ non của cđy că chua rồi tưới dung dịch vi khuẩn 107 cfu/ml (OD= 0,14) văo cốc.
Chuẩn bị dịch vi khuẩn: lấy mẫu vi khuẩn đê phđn lập được lưu giữ ở phòng đem cấy rải trín môi trường 523 để thu sinh khối. Sau 48-72 giờ thì thím nước cất vô trùng văo từng đĩa cấy, gạt đều thănh dịch vi khuẩn.
2.5.6.2. Bố trí thí ngiệm
Bố trí thí nghiệm theo sơ đồ ô lớn ô nhỏ (Split Plot Design). Mô hình thí nghiệm hai yếu tố, xem xĩt mức độ ảnh hưởng chính của một trong hai yếu tố lă giống că chua vă chủng vi khuẩn.
Thí nghiệm gồm 3 giống că chua: TN52 (giống trồng phổ biến ở câc tỉnh miền Nam), W700 (giống chuẩn nhiễm), H7996 (giống chuẩn khâng) vă 6 chủng vi khuẩn được thu thập từ câc tỉnh ở phía Nam, gồm: Lđm Đồng, thănh phố Hồ Chí Minh, Tiền Giang, Vĩnh Long, Cần Thơ vă Ninh Thuận.
Tiến hănh bố trí thí nghiệm (Sơ đồ 2.1): mỗi ô nhỏ lă một chủng vi khuẩn, mỗi chủng được lặp lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại 5 cđy. Thực hiện thí nghiệm cho 3 giống că chua khâc nhau.
Bảo vệ Bảo vệ IIa Ib IVc Bảo vệ IIIa Vb VIc VIa IIIb Ic Ia IVb Vc
IVa IIb IIIc
Va VIb IIc
Bảo vệ
Sơ đồ 2.1. Bố trí thí nghiệm cho một giống că chua 2.5.6.3. Phương phâp đânh giâ
Đânh giâ tình hình nhiễm bệnh tại 4, 7, 14, 21 vă 28 ngăy sau lđy nhiễm, theo thang điểm từ 0-5 Winstead vă Kelman (1952) [97].
0 điểm: Không có triệu chứng 1 điểm: Một lâ hĩo
2 điểm: Hai đến ba lâ hĩo 3 điểm: từ 4 lâ trở lín bị hĩo 4 điểm: toăn cđy bị hĩo
5 điểm: cđy bị chết do bệnh HXVK.
Hình 2.1. Thang điểm đânh giâ diễn biến bệnh HXVK
Khâng cao (HK): >90% cđy sống sót (hay số cđy chết <10%) Khâng (R): 70 - 90 % cđy sống sót ( hay số cđy chết =11 - 30%)
Nhiễm trung bình (MS): 50 - 70% cđy sống sót (hay số cđy chết =31 - 50%) Nhiễm nặng (HS): 10 - 49% cđy sống sót (hay số cđy chết = 51 - 90%)
* Câc chỉ tiíu theo dõi:
+ Tỷ lệ bệnh
TLB (%) = A/B*100 Trong đó: A: Số cđy bị bệnh
B: Số cđy điều tra
+ Chỉ số bệnh
CSB (%) = [(N0 x 0 + N1 x 1 + N2 x 2 + N3 x 3 + N4 x 4+ N5 x 5)/(NT x 5)] x 100 Trong đó: N0-N5: số cđy bị bệnh tương ứng ở mỗi cấp
NT: Tổng số cđy điều tra
2.5.6.4. Phương phâp xử lý số liệu
Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÍN CỨU VĂ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ NGHIÍN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIÍ̉M HÌNH THÂI KHUẨN LẠC
CỦA CÂC CHỦNG VI KHUẨN RALSTONIA SOLANACEARUM
Vi khuẩn Ralstonia solanacearum lă loăi ký sinh đa thực, có phạm vi ký chủ rộng, gđy nhiễm trín nhiều loại cđy trồng khâc nhau. Chủ yếu lă những cđy thuộc họ că, họ đậu....Ở nước ta, với điều kiện khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, bệnh HXVK phât sinh, phât triển vă gđy hại phổ biến ở câc vùng sinh thâi khâc nhau. Nghiín cứu một số đặc điểm hình thâi khuẩn lạc lă cơ sở quan trọng cho việc nhận dạng vi khuẩn gđy bệnh hĩo xanh. Chính vì vậy chúng tôi đê tiến hănh thu thập mẫu bệnh có triệu chứng hĩo xanh vi khuẩn trín một số cđy họ că tại câc tỉnh phía Nam.
Kết quả chúng tôi đê thu thập được 93 mẫu bệnh trín câc ruộng trồng rau của 7 tỉnh ở phía Nam. Công việc xử lý mẫu được tiến hănh tại phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học. Âp dụng phương phâp chẩn đoân nhanh bệnh HXVK bằng phương phâp ngđm một đoạn gốc thđn của mẫu cđy văo nước cất vô trùng đê thu được 42 mẫu (Bảng 3.1) chảy ra dịch nhầy mău trắng sữa (Hình 3.1).
Bảng 3.1. Danh sâch câc chủng vi khuẩn được phđn lập
STT Ký hiệu
mẫu Địa điểm thu mẫu Tỉnh Đối tượng
1 Rs4 Trung tđm nghiín cứu Rau Hoa, Phường
12 Đă Lạt (Vườn B2) Lđm Đồng Khoai tđy
2 Rs5 Trung tđm nghiín cứu Rau Hoa, Phường
12 Đă Lạt (Vườn B2) Lđm Đồng Khoai tđy
3 Rs6 Trung tđm nghiín cứu Rau Hoa, Phường
12 Đă Lạt (Vườn B2) Lđm Đồng Khoai tđy
4 Rs10 Trung tđm nghiín cứu Rau Hoa, Phường
12 Đă Lạt (Vườn B7c) Lđm Đồng Khoai tđy
5 Rs11 Trung tđm nghiín cứu Rau Hoa, Phường
12 Đă Lạt (Vườn B7c) Lđm Đồng Khoai tđy
6 Rs12 Trung tđm nghiín cứu Rau Hoa, Phường
12 Đă Lạt (Vườn B7c) Lđm Đồng Că chua
7 Rs15 Nhă ông Dũng, Phường 8, Tp. Đă Lạt Lđm Đồng Că chua 8 Rs18 Nhă ông Điểu, thôn Tđn An, xê Hiệp An,
huyện Đức Trọng, Lđm Đồng Lđm Đồng Că chua 9 Rs19 Nhă ông Điểu, thôn Tđn An, xê Hiệp An,
huyện Đức Trọng, Lđm Đồng Lđm Đồng Că chua 10 Rs24 Xê Hiệp Trung, Đức Trọng, Lđm Đồng Lđm Đồng Ớt
11 Rs25 Thôn 1, xê Đạ Ròn, huyện Đơn Dương Lđm Đồng Că chua 12 Rs26 Hộ Khiím Nhi, thôn 1, xê Đạ Ròn, huyện
Đơn Dương Lđm Đồng Că chua
13 Rs27 Hộ Khiím Nhi, thôn 1, xê Đạ Ròn, huyện
Đơn Dương Lđm Đồng Că chua
14 Rs28 Thôn Suối thông B1, xê Đạ Ròn, huyện
Đơn Dương Lđm Đồng Că chua
15 Rs29 Thôn Suối thông B1, xê Đạ Ròn, huyện
Đơn Dương Lđm Đồng Că chua
16 Rs32A Đ́p Trung Viết, xê Phước Hiệp, huyện Củ Chi
Thănh phố
Hồ Chí Minh Ớt 17 Rs38B Đ́p Trung Viết, xê Phước Hiệp, huyện Củ
Chi
Thănh phố
Hồ Chí Minh Ớt 18 Rs40B Đ́p Trung Viết, xê Phước Hiệp, huyện Củ
Chi
Thănh phố
Hồ Chí Minh Ớt 10 Rs42 Đ́p Trung Viết, xê Phước Hiệp, huyện Củ
Chi
Thănh phố
Hồ Chí Minh Ớt 20 Rs43 Đ́p Xóm Đồng, xê Tđn Phú Trung, huyện
Củ Chi
Thănh phố
Hồ Chí Minh Ớt 21 Rs44 Đ́p Xóm Đồng, xê Tđn Phú Trung, huyện
Củ Chi
Thănh phố
Hồ Chí Minh Ớt 22 Rs47 xê Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi Thănh phố
Hồ Chí Minh Că dí 23 Rs48 xê Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi Thănh phố
Hồ Chí Minh Că dí 24 Rs49 xê Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi Thănh phố
Hồ Chí Minh Că dí 25 Rs50 xê Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi Thănh phố
Hồ Chí Minh Că dí 26 Rs51 Đ́p Thạnh An, xê An Thạnh Thủy, huyện
Chợ Gạo Tiền Giang Ớt
27 Rs52 Xê Bình Ninh, huyện Chợ Gạo Tiền Giang Ớt