4. NHỮNG ĐIÍ̉M MỚI CỦA ĐÍ̀ TÀI
2.5.2. Phương phâp phđn lập vi khuẩn Ralstonia solanacearum
+ Phương phâp xử lý mẫu: Sau khi được rửa sạch bằng nước mây vă sât trùng bề mặt bằng cồn 75o, câc mẫu bệnh được cắt ngang một đoạn ở phần cuối gốc thđn vă ngđm trong ống nghiệm chứa 25 ml nước cất vô trùng, để ở nhiệt độ phòng. Sau 5 ÷ 10 phút có thể quan sât thấy một dòng dịch vi khuẩn mău trắng sữa chảy ra từ mẫu bệnh. Sau 20 phút loại bỏ đoạn thđn nhiễm bệnh ra khỏi ống chứa dịch vi khuẩn vă chia nhỏ thănh ra 3 ống eppendorf mới. Những ống dịch năy được bảo quản ở nhiệt độ 27oC, 4oC vă -10oC.
+ Phđn lập vă lăm thuần câc chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum: pha loêng dịch vi khuẩn ở câc nồng độ khâc nhau 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 để cấy gạt trín môi trường TTC [63] nhằm thu được câc khuẩn lạc riíng biệt. Mẫu sau khi cấy gạt được nuôi giữ trong tủ định ôn ở nhiệt độ 28oC ± 2oC.
Theo dõi vă ghi kết quả sau 48-72 giờ. Từ mỗi nhóm hình thâi khuẩn lạc tiến hănh chọn 3 đến 5 khuẩn lạc tiếp tục cấy gạt trín môi trường TTC để lăm thuần vi khuẩn. Mẫu sau khi cấy gạt được nuôi giữ trong tủ định ôn ở nhiệt độ 28oC ± 2oC.
Theo dõi kết quả sau 48-72 giờ. Tiếp tục từ mỗi nhóm khuẩn lạc đặc trưng riíng rẽ, chọn 3 đến 5 khuẩn lạc lưu giữ trong 0,2 ml nước cất vô trùng cho mỗi ống eppendorf 1,5 ml bảo quản ở nhiệt độ phòng vă 4oC. Chọn tiếp 3 đến 5 khuẩn lạc khâc
lưu giữ trong 0,2 ml glyxerol 30% cho mỗi ống eppendorf 1,5 ml bảo quản ở nhiệt độ - 10oC nhằm lưu giữ mẫu cho câc thí nghiệm sau.
+ Phương phâp xâc định vi khuẩn Ralstonia solanacearum bằng kỹ thuật PCR: sử dụng cặp mồi AU.P759/760 [78] đặc hiệu cho loăi vi khuẩn Ralstonia solanacearum.
Mỗi phản ứng sẽ lă 25 µl, trong đó gồm nước cất vô trùng: 12,8 µl; 5X buffer: 5 µl; primer: 1 µl/primer; Taq polymerase: 0,2 µl vă DNA: 5 µl.
Khuếch đại PCR theo chu trình nhiệt: bước 1 gồm 1 chu kỳ ở 94 oC trong 3 phút, 53 oC trong 1 phút, 72 oC trong 1.5 phút; bước 2 gồm 30 chu kỳ ở 94 oC trong 0.3 phút, 60 oC trong 0.3 phút, 72 oC trong 0.3 phút; bước 3 gồm 1 chu kỳ ở 72 oC trong 5 phút vă cuối cùng ủ ở 4 oC.
Sản phẩm PCR sau đó thím 5 µl chất nhuộm chứa SYBR Green, ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 20 phút. Sau đó đem điện di trín agarose gel 1% trong dung dịch TBE 0,5X.
Sản phẩm điện di được soi trín đỉn UV vă chụp ảnh.