4. NHỮNG ĐIÍ̉M MỚI CỦA ĐÍ̀ TÀI
2.5.4. Phương phâp xâc định phylotype của vi khuẩn Ralstonia solanacearum
Sử dụng bộ mồi phylotype (Bảng 2.5) đặc hiệu để tiến hănh xâc định phylotype của câc chủng phđn lập được.
Bảng 2.5. Bộ mồi xâc định phylotype của vi khuẩn Ralstonia solanacearum
Tín mồi Trình tự mồi Kích thước băng DNA
Nmult: 21: 1F CGTTGATGAGGCGCGCAATTT 144 bp
Nmult: 21: 2F AAGTTATGGACGGTGGAAGTC 372 bp
Nmult: 22: InF ATTGCCAAGACGAGAGAAGTA 213 bp
Nmult: 23: AF ATTACGAGAGCAATCGAAAGATT 91 bp
Nmult: 22: RR TCGCTTGACCCTATAACGAGTA
759 GTCGCCGTCAACTCACTTTCC
280 bp
Mỗi phản ứng sẽ lă 25 µl, trong đó bao gồm: 5X buffer: 5 µl; MgCl2: 2 µl; dNTP: 0,5 µl; Mix primer: 2,5 µl; Taq-polymerase: 0,2 µl vă DNA: 14,8 µl.
Khuếch đại PCR theo chu kỳ nhiệt: bước 1 gồm 1 chu kỳ ở 96 oC trong 10 phút; bước 2 gồm 30 chu kỳ: 94 oC ở 0,5 phút, 59 oC ở 1,5 phút, 72 oC ở 1,5 phút; bước 3 gồm 1 chu kì ở 72 oC trong 20 phút vă cuối cùng ủ ở 11 oC.
Sản phẩm PCR sau đó thím 5 µl chất nhuộm chứa SYBR Green, ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 20 phút. Sau đó đem điện di trín agarose gel 2% trong dung dịch TBE 0,5X.
Sản phẩm điện di được soi trín đỉn UV vă chụp ảnh.
2.5.5. Phương phâp đânh giâ đa dạng di truyền vi khuẩn Ralstonia solanacearum
Sử dụng bộ mồi RAPD (100 cặp mồi) để tiến hănh kỹ thuật đa hình RAPD. Mỗi phản ứng sẽ lă 15 µl, trong đó bao gồm: nước cất vô trùng: 4,3 µl, 5X buffer: 3 µl; MgCl2 (25Mm): 1 µl; dNTP (10Mm): 0,5 µl; primer: 1 µl; Taq polymerase: 0,2 µl vă DNA: 5 µl.
Khuyếch đại PCR theo chu kì nhiệt: bước 1 gồm 1 chu kỳ ở 94oC trong 3 phút; bước 2 gồm 40 chu kỳ: 94oC trong 1phút, 37oC trong 1 phút, 72oC trong 2 phút; bước 3 gồm 1 chu kỳ ở 72oC trong 7 phút vă cuối cùng ủ ở 4oC.
Sản phẩm PCR sau đó thím 5 µl chất nhuộm chứa SYBR Green, ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 20 phút. Sau đó đem điện di trín agarose gel 1% trong dung dịch TBE 0,5X.
Sản phẩm điện di được soi trín đỉn UV vă chụp ảnh.
* Câc chỉ tiíu theo dõi
- Số băng được khuếch đại ở mỗi chủng của mỗi chỉ thị đa hình RAPD. - Tổng số băng đếm được của mỗi chủng với câc chỉ thị đa hình RAPD. - Số băng biểu hiện đa hình của mỗi chủng với câc chỉ thị đa hình RAPD. - Tổng số băng đa hình biểu hiện đa hình của mỗi chủng.
- Tỷ lệ băng đa hình của mỗi chủng (%).
Số liệu RAPD được ghi nhận dựa văo thang chuẩn 100bp. Tiíu chuẩn hóa sản phẩm RAPD theo quy ước: “1” xuất hiện phđn đoạn DNA, “0” không xuất hiện phđn đoạn DNA. Câc số liệu năy sẽ được đưa văo chương trình NTSYS – pc để tính ma trận tương đồng giữa câc đôi mẫu. Việc tính toân ma trận tương đồng dựa trín công thức:
Jij = a/(n-d)
Trong đó: a: lă số băng DNA có cả ở 2 giống i vă j
d: lă số băng DNA không có trong cả 2 giống I vă J. n: lă tổng số băng DNA thu được của 2 giống
Sau đó câc mẫu thí nghiệm được xử lý tiếp trong phần mềm Treecon để xâc định hệ số tương đồng di truyền vă cuối cùng được biểu hiện trín biểu đồ quan hệ di truyền.