4. NHỮNG ĐIÍ̉M MỚI CỦA ĐÍ̀ TÀI
2.5.6. Phương phâp lđy nhiễm nhđn tạo
2.5.6.1. Câch thực hiện
Gieo hạt 3 giống că chua văo câc cốc nhựa có đường kính 5,7 cm (Bảng 2.2), đến lúc că chua được 4-5 lâ thì tiến hănh lđy nhiễm nhđn tạo với một số chủng vi khuẩn
Ralstonia solanacearum đê phđn lập được.
Cụ thể: sau khi gieo 30 ngăy (4-5 lâ thật) cđy trong cốc được gđy xât thương phần rễ non của cđy că chua rồi tưới dung dịch vi khuẩn 107 cfu/ml (OD= 0,14) văo cốc.
Chuẩn bị dịch vi khuẩn: lấy mẫu vi khuẩn đê phđn lập được lưu giữ ở phòng đem cấy rải trín môi trường 523 để thu sinh khối. Sau 48-72 giờ thì thím nước cất vô trùng văo từng đĩa cấy, gạt đều thănh dịch vi khuẩn.
2.5.6.2. Bố trí thí ngiệm
Bố trí thí nghiệm theo sơ đồ ô lớn ô nhỏ (Split Plot Design). Mô hình thí nghiệm hai yếu tố, xem xĩt mức độ ảnh hưởng chính của một trong hai yếu tố lă giống că chua vă chủng vi khuẩn.
Thí nghiệm gồm 3 giống că chua: TN52 (giống trồng phổ biến ở câc tỉnh miền Nam), W700 (giống chuẩn nhiễm), H7996 (giống chuẩn khâng) vă 6 chủng vi khuẩn được thu thập từ câc tỉnh ở phía Nam, gồm: Lđm Đồng, thănh phố Hồ Chí Minh, Tiền Giang, Vĩnh Long, Cần Thơ vă Ninh Thuận.
Tiến hănh bố trí thí nghiệm (Sơ đồ 2.1): mỗi ô nhỏ lă một chủng vi khuẩn, mỗi chủng được lặp lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại 5 cđy. Thực hiện thí nghiệm cho 3 giống că chua khâc nhau.
Bảo vệ Bảo vệ IIa Ib IVc Bảo vệ IIIa Vb VIc VIa IIIb Ic Ia IVb Vc
IVa IIb IIIc
Va VIb IIc
Bảo vệ
Sơ đồ 2.1. Bố trí thí nghiệm cho một giống că chua 2.5.6.3. Phương phâp đânh giâ
Đânh giâ tình hình nhiễm bệnh tại 4, 7, 14, 21 vă 28 ngăy sau lđy nhiễm, theo thang điểm từ 0-5 Winstead vă Kelman (1952) [97].
0 điểm: Không có triệu chứng 1 điểm: Một lâ hĩo
2 điểm: Hai đến ba lâ hĩo 3 điểm: từ 4 lâ trở lín bị hĩo 4 điểm: toăn cđy bị hĩo
5 điểm: cđy bị chết do bệnh HXVK.
Hình 2.1. Thang điểm đânh giâ diễn biến bệnh HXVK
Khâng cao (HK): >90% cđy sống sót (hay số cđy chết <10%) Khâng (R): 70 - 90 % cđy sống sót ( hay số cđy chết =11 - 30%)
Nhiễm trung bình (MS): 50 - 70% cđy sống sót (hay số cđy chết =31 - 50%) Nhiễm nặng (HS): 10 - 49% cđy sống sót (hay số cđy chết = 51 - 90%)
* Câc chỉ tiíu theo dõi:
+ Tỷ lệ bệnh
TLB (%) = A/B*100 Trong đó: A: Số cđy bị bệnh
B: Số cđy điều tra
+ Chỉ số bệnh
CSB (%) = [(N0 x 0 + N1 x 1 + N2 x 2 + N3 x 3 + N4 x 4+ N5 x 5)/(NT x 5)] x 100 Trong đó: N0-N5: số cđy bị bệnh tương ứng ở mỗi cấp
NT: Tổng số cđy điều tra
2.5.6.4. Phương phâp xử lý số liệu
Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÍN CỨU VĂ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ NGHIÍN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIÍ̉M HÌNH THÂI KHUẨN LẠC
CỦA CÂC CHỦNG VI KHUẨN RALSTONIA SOLANACEARUM
Vi khuẩn Ralstonia solanacearum lă loăi ký sinh đa thực, có phạm vi ký chủ rộng, gđy nhiễm trín nhiều loại cđy trồng khâc nhau. Chủ yếu lă những cđy thuộc họ că, họ đậu....Ở nước ta, với điều kiện khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, bệnh HXVK phât sinh, phât triển vă gđy hại phổ biến ở câc vùng sinh thâi khâc nhau. Nghiín cứu một số đặc điểm hình thâi khuẩn lạc lă cơ sở quan trọng cho việc nhận dạng vi khuẩn gđy bệnh hĩo xanh. Chính vì vậy chúng tôi đê tiến hănh thu thập mẫu bệnh có triệu chứng hĩo xanh vi khuẩn trín một số cđy họ că tại câc tỉnh phía Nam.
Kết quả chúng tôi đê thu thập được 93 mẫu bệnh trín câc ruộng trồng rau của 7 tỉnh ở phía Nam. Công việc xử lý mẫu được tiến hănh tại phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học. Âp dụng phương phâp chẩn đoân nhanh bệnh HXVK bằng phương phâp ngđm một đoạn gốc thđn của mẫu cđy văo nước cất vô trùng đê thu được 42 mẫu (Bảng 3.1) chảy ra dịch nhầy mău trắng sữa (Hình 3.1).
Bảng 3.1. Danh sâch câc chủng vi khuẩn được phđn lập
STT Ký hiệu
mẫu Địa điểm thu mẫu Tỉnh Đối tượng
1 Rs4 Trung tđm nghiín cứu Rau Hoa, Phường
12 Đă Lạt (Vườn B2) Lđm Đồng Khoai tđy
2 Rs5 Trung tđm nghiín cứu Rau Hoa, Phường
12 Đă Lạt (Vườn B2) Lđm Đồng Khoai tđy
3 Rs6 Trung tđm nghiín cứu Rau Hoa, Phường
12 Đă Lạt (Vườn B2) Lđm Đồng Khoai tđy
4 Rs10 Trung tđm nghiín cứu Rau Hoa, Phường
12 Đă Lạt (Vườn B7c) Lđm Đồng Khoai tđy
5 Rs11 Trung tđm nghiín cứu Rau Hoa, Phường
12 Đă Lạt (Vườn B7c) Lđm Đồng Khoai tđy
6 Rs12 Trung tđm nghiín cứu Rau Hoa, Phường
12 Đă Lạt (Vườn B7c) Lđm Đồng Că chua
7 Rs15 Nhă ông Dũng, Phường 8, Tp. Đă Lạt Lđm Đồng Că chua 8 Rs18 Nhă ông Điểu, thôn Tđn An, xê Hiệp An,
huyện Đức Trọng, Lđm Đồng Lđm Đồng Că chua 9 Rs19 Nhă ông Điểu, thôn Tđn An, xê Hiệp An,
huyện Đức Trọng, Lđm Đồng Lđm Đồng Că chua 10 Rs24 Xê Hiệp Trung, Đức Trọng, Lđm Đồng Lđm Đồng Ớt
11 Rs25 Thôn 1, xê Đạ Ròn, huyện Đơn Dương Lđm Đồng Că chua 12 Rs26 Hộ Khiím Nhi, thôn 1, xê Đạ Ròn, huyện
Đơn Dương Lđm Đồng Că chua
13 Rs27 Hộ Khiím Nhi, thôn 1, xê Đạ Ròn, huyện
Đơn Dương Lđm Đồng Că chua
14 Rs28 Thôn Suối thông B1, xê Đạ Ròn, huyện
Đơn Dương Lđm Đồng Că chua
15 Rs29 Thôn Suối thông B1, xê Đạ Ròn, huyện
Đơn Dương Lđm Đồng Că chua
16 Rs32A Đ́p Trung Viết, xê Phước Hiệp, huyện Củ Chi
Thănh phố
Hồ Chí Minh Ớt 17 Rs38B Đ́p Trung Viết, xê Phước Hiệp, huyện Củ
Chi
Thănh phố
Hồ Chí Minh Ớt 18 Rs40B Đ́p Trung Viết, xê Phước Hiệp, huyện Củ
Chi
Thănh phố
Hồ Chí Minh Ớt 10 Rs42 Đ́p Trung Viết, xê Phước Hiệp, huyện Củ
Chi
Thănh phố
Hồ Chí Minh Ớt 20 Rs43 Đ́p Xóm Đồng, xê Tđn Phú Trung, huyện
Củ Chi
Thănh phố
Hồ Chí Minh Ớt 21 Rs44 Đ́p Xóm Đồng, xê Tđn Phú Trung, huyện
Củ Chi
Thănh phố
Hồ Chí Minh Ớt 22 Rs47 xê Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi Thănh phố
Hồ Chí Minh Că dí 23 Rs48 xê Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi Thănh phố
Hồ Chí Minh Că dí 24 Rs49 xê Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi Thănh phố
Hồ Chí Minh Că dí 25 Rs50 xê Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi Thănh phố
Hồ Chí Minh Că dí 26 Rs51 Đ́p Thạnh An, xê An Thạnh Thủy, huyện
Chợ Gạo Tiền Giang Ớt
27 Rs52 Xê Bình Ninh, huyện Chợ Gạo Tiền Giang Ớt 28 Rs53 Xê Bình Ninh, huyện Chợ Gạo Tiền Giang Ớt 29 Rs54 Xê Bình Ninh, huyện Chợ Gạo Tiền Giang Ớt 30 Rs55 Thănh Nhơn, xê Thănh Lợi, huyện Bình
Tđn, Vĩnh Long Vĩnh Long Ớt
31 Rs57 Thănh Nhơn, xê Thănh Lợi, huyện Bình
Tđn, Vĩnh Long Vĩnh Long Ớt
32 Rs60 Khu vực Tđn Thạnh, phường Trường Lạc,
quận Ô Môn Cần Thơ Că dí
33 Rs61 Khu vực Tđn Thạnh, phường Trường Lạc,
34 Rs62 Khu vực Tđn Thạnh, phường Trường Lạc,
quận Ô Môn Cần Thơ Că dí
35 Rs66 Khu vực Tđn Thạnh, phường Trường Lạc,
quận Ô Môn Cần Thơ Dưa hấu
36 Rs83 Khu vực Phúc Lộc 3, phường Thạnh Hòa,
quận Thốt Nốt Cần Thơ Ớt
37 Rs84 Khu vực Phúc Lộc 3, phường Thạnh Hòa,
quận Thốt Nốt Cần Thơ Ớt
38 Rs85 Khu vực Phúc Lộc 3, phường Thạnh Hòa,
quận Thốt Nốt Cần Thơ Ớt
39 Rs86 Thuận Bắc, Tp Phan Rang, Ninh Thuận Ninh Thuận Ớt 40 Rs87 Thuận Bắc, Tp Phan Rang, Ninh Thuận Ninh Thuận Ớt 41 Rs88 Thuận Bắc, Tp Phan Rang, Ninh Thuận Ninh Thuận Ớt
42 Rs91 Mộ Đức (Quảng Ngêi) Quảng Ngêi Ớt
Hình 3.1. Dịch nhầy trắng sữa của vi khuẩn
42 mẫu vi khuẩn đê được xâc định lă vi khuẩn Ralstonia solanacearum bằng phương phâp chẩn đoân nhanh được chúng tôi sử dụng để nuôi cấy phđn lập vă lăm thuần bằng môi trường TTC nhằm phục vụ cho việc nghiín cứu đặc điểm hình thâi, mău sắc khuẩn lạc đặc trưng của câc chủng vi khuẩn.
Ralstonia solanacearum lă loăi vi khuẩn có khả năng biến dị nhanh. Chúng luôn có xu hướng mất đi độc tính vă hình thâi khuẩn lạc của chúng có thể thay đổi từ dạng
chảy sang dạng không chảy. Do đó, kỹ thuật chọn những khuẩn lạc chảy lă cần thiết trong việc duy trì, bảo quản câc chủng vi khuẩn có độc tính mạnh.
Sau khi tiến hănh phđn lập trín môi trường TTC được 48 giờ, kết quả quan sât cho thấy câc chủng vi khuẩn nghiín cứu có nhiều kiểu khuẩn lạc biến thể khâc nhau. Tuy nhiín nhìn chung tất cả 42 mẫu dịch vi khuẩn đều biểu hiện mău sắc khuẩn lạc đặc trưng của vi khuẩn Ralstonia solanacearum: khuẩn lạc mău trắng, thể nhầy lỏng, khoanh tròn mực với mău phớt hồng ở tđm (Hình 3.2). Qua đó có thể khẳng định loăi
Ralstonia solanacearum lă loăi ký sinh đa thực, có tính chuyín hóa rộng, gđy nhiễm vă phâ hại trín nhiều loăi cđy trồng khâc nhau.
Hình 3.2. Hình thâi khuẩn lạc đặc trưng
Hình 3.3. Một số hình thâi khuẩn lạc đại diện khâc
3.2. KẾT QUẢ NGHIÍN CỨU ĐÂNH GIÂ ĐA DẠNG DI TRUYỀN
3.2.1. Kết quả xâc định vi khuẩn Ralstonia solanacearum bằng chỉ thị phđn tử
Việc nhận dạng nhanh một chủng vi khuẩn lă rất cần thiết cho công tâc bảo vệ thực vật. Đối với vi khuẩn Ralstonia solanacearum, chúng ta có thể giâm định nhanh bằng phương phâp quan sât dịch vi khuẩn chảy ra từ thđn cđy bị nhiễm bệnh hoặc phđn lập, lăm thuần vă quan sât khuẩn lạc đặc trưng của vi khuẩn trín môi trường đặc hiệu. Tuy nhiín, để xâc định chính xâc về mặt di truyền, chúng tôi đê phđn tích PCR với cặp
mồi đặc hiệu của vi khuẩn Ralstonia solanacearum. Cũng trong nghiín cứu năy nhằm tăng thím độ chính xâc, chúng tôi sử dụng 2 mẫu vi khuẩn chuẩn Ralstonia solanacearum đối với 42 chủng vi khuẩn đê được lăm thuần được cung cấp bởi Trung tđm rau thế giới lă Pss4 vă Pss186 phđn lập tại Đăi Loan lăm đối chứng.
Kết quả phđn tích PCR của 42 chủng vi khuẩn thu thập ở câc tỉnh phía Nam với cặp mồi đặc hiệu được trình băy ở Hình 3.4.
Qua Hình 3.4 cho thấy cả 42 chủng vi khuẩn đê phđn lập đều cho sản phẩm PCR dương tính với cặp mồi P759/760. Ảnh điện di sản phẩm PCR cho thấy câc chủng năy đều cho 1 vạch sắc nĩt tương đương với 2 chủng đối chứng Pss4 (ĐC1) vă Pss186 (ĐC2) vă có kích thước bằng hoặc xấp xỉ bằng 280bp (vị trí DNA đặc thù cho vi khuẩn khi sử dụng cặp mồi đặc hiệu). Như vậy, có thể kết luận rằng cả 42 chủng vi khuẩn đê phđn lập được chính lă câc chủng vi khuẩn thuộc loăi Ralstonia solanacearum.
Từ 42 chủng vi khuẩn trín chúng tôi tiếp tục chọn ra 19 chủng vi khuẩn có băng DNA đẹp, rõ nĩt nhất vă được thu thập khâc nhau về vùng địa lý vă ký chủ gđy bệnh để thực hiện cho câc thí nghiệm tiếp theo.
Hình 3.4. Kết quả điện di sử dụng cặp mồi đặc hiệu của vi khuẩn Ralstonia solanacearum
[M: 100bp ladder, 1-Rs11, 2-Rs15, 3-Rs18, 4-Rs24, 5-Rs25, 6-Rs26, 7-Rs27, 8-Rs28, 9-Rs38, 10-Rs44, 11-Rs47, 12-Rs51, 13-Rs53, 14-Pss4 (ĐC1), 15-Rs57, 16-Rs61, 17-
3.2.2 Kết quả tâch chiết DNA
Tâch chiết DNA lă cần thiết bởi câc thực nghiệm đânh giâ đa dạng di truyền đều tiến hănh với DNA. DNA tâch chiết cần đảm bảo được độ tinh khiết vă độ nguyín vẹn về cấu trúc để thực hiện câc khđu trong kỹ thuật PCR.
Tùy thuộc văo cấu tạo của từng loăi vi sinh vật vă kích thước DNA của chúng để chọn phương phâp tâch chiết khâc nhau nhằm đảm bảo tâch chiết được DNA tinh sạch vă hiệu suất cao nhất. Đối với vi khuẩn Ralstonia solanacearum phương phâp để thu được DNA tinh sạch không cần sử dụng quâ nhiều hóa chất vă dụng cụ như đối với câc đối tượng vi sinh vật khâc. Theo phương phâp của Kuo (1993) đun sôi câc khuẩn lạc với dung dịch đệm TE đê phâ vỡ được tế băo vi khuẩn vă tâch chiết được DNA tổng số.
Chúng tôi tiến hănh tâch chiết DNA của 19 chủng vi khuẩn theo quy trình tâch chiết như đê níu ở mục 2.5.3. Sau khi điện di, kết quả thu được thể thể hiện trong Hình 3.5
Hình 3.5 cho thấy DNA tổng số tâch chiết được nhiều ít khâc nhau thể hiện ở câc băng DNA có mău sâng đậm, nhạt không đều nhau.
Với mục tiíu thu được DNA tổng số của 19 mẫu vi khuẩn đồng đều như nhau, chúng tôi thực hiện pha loêng đối với câc chủng có băng DNA mău đậm sao cho giữa câc chủng có băng kiểm tra cuối cùng có mău sâng đồng đều.
Hình 3.5. Kết quả tâch chiết DNA lần đầu của 19 chủng vi khuẩn
(1-Rs11, 2-Rs15, 3-Rs18, 4-Rs24, 5-Rs25, 6-Rs26, 7-Rs27, 8-Rs28, 9-Rs38, 10-Rs44, 11-Rs47, 12-Rs51, 13-Rs53, 14-Rs57, 15-Rs61, 16-Rs66, 17-Rs83, 18-Rs86, 19-Rs91)
Hình 3.6. Kết quả tâch chiết DNA hoăn chỉnh của 19 chủng vi khuẩn
(1-Rs11, 2-Rs15, 3-Rs18, 4-Rs24, 5-Rs25, 6-Rs26, 7-Rs27, 8-Rs28, 9-Rs38, 10-Rs44, 11-Rs47, 12-Rs51, 13-Rs53, 14-Rs57, 15-Rs61, 16-Rs66, 17-Rs83, 18-Rs86, 19-Rs91)
Quan sât hình ảnh DNA Hình 3.6 cho thấy, câc băng DNA thu được có mău sâng đồng đều nhau, chất lượng khâ tốt, không bị gêy hay lẫn tạp. Nồng độ DNA đủ tiíu chuẩn để thực hiện phản ứng PCR tiếp theo.
3.2.3. Kết quả nghiín cứu xâc định phylotype của 19 chủng vi khuẩn vi khuẩn
Ralstonia solanacearum
Nghiín cứu xâc định phylotype của loăi vi khuẩn Ralstonia solanacearum gđy bệnh hĩo xanh lă một trong những vấn đề quan trọng, góp phần xđy dựng cơ sở khoa học để xđy dựng câc biện phâp quản lý bệnh có hiệu quả. Theo câc nghiín cứu từ trước trín thế giới, câc nhă khoa học nghiín cứu về vi khuẩn Ralstonia solanacearum
đê xâc định được 4 nhóm phylotype (phylotype I: có nguồn gốc từ chđu Â; phylotype II: có nguồn gốc từ chđu Mỹ, phylotype III: có nguồn gốc từ chđu Phi; phylotype IV: có nguồn gốc từ Indonesia). Đặc điểm phât sinh, phât triển của bệnh biến động không chỉ tùy thuộc văo chủng loại giống cđy trồng mă còn bị ảnh hưởng nhiều đến phạm vi địa lý, câc điều kiện sinh thâi của vùng. Vì vậy, việc nghiín cứu xâc định phylotype của loăi dựa văo chuỗi gen riboxom 16S quy định rARN của vi khuẩn lă rất cần thiết cho câc công tâc nghiín cứu về bệnh liín quan.
Để xâc định câc chủng vi khuẩn phđn lập tại câc tỉnh phía Nam Việt Nam thuộc phylotype năo, chúng tôi đê âp dụng kỹ thuật phđn tích PCR với bộ mồi đặc hiệu phylotype (Bảng 2.5) đối với 19 chủng vi khuẩn. Sau khi điện di trín gel agarose 2%, sản phẩm thu được có 2 băng DNA, trong đó 1 băng có kích thước trong khoảng 280bp biểu hiện vi khuẩn vă 1 băng có kích thước trong khoảng 144bp. Vị trí xuất hiện băng cho thấy 19 chủng vi khuẩn trong nghiín cứu thuộc phylotype I phù hợp với câc nghiín cứu từ trước về phạm vi địa lý thuộc khu vực chđu Â.
Hình 3.7. Kết quả điện di phylotype của 19 chủng vi khuẩn.
(M: 100bp DNA ladder, 1-Rs11, 2-Rs15, 3-Rs18, 4-Rs24, 5-Rs25, 6-Rs26, 7-Rs27, 8- Rs28, 9-Rs38, 10-Rs44, 11-Rs47, 12-Rs51, 13-Rs53, 14-Rs57, 15-Rs61, 16-Rs66, 17-
Rs83, 18-Rs86, 19-Rs91)
3.2.4. Kết quả phđn tích đa hình bằng kỹ thuật RAPD
Đânh giâ đa dạng di truyền để khai thâc sử dụng nguồn gen lă vô cùng cần thiết góp phần hữu ích trong công tâc chọn tạo giống khâng bệnh. Đânh giâ mức độ đa dạng di truyền của câc chủng vi khuẩn, ngoăi sử dụng câc đặc điểm hình thâi của khuẩn lạc, việc âp dụng chỉ thị phđn tử DNA, cụ thể lă chỉ thị RAPD được coi lă phương phâp hữu hiệu.
RAPD lă chỉ thị nhđn ngẫu nhiín câc đoạn DNA trong genome trín cơ sở phương phâp PCR dùng một đoạn mồi. Câc mồi năy sẽ bắt cặp một câch ngẫu nhiín văo DNA khuôn ở một vị trí bất kỳ mă tại đó có trình tự bổ sung với nó. Chỉ thị RAPD phât hiện tính đa dạng đâng tin (sự mất đoạn nhiễm sắc, sự thay đổi, thím bớt nucleotit, xen đoạn…đều lăm thay đổi kích thước đoạn nhđn bản).
Để phđn tích tính đa hình DNA của 19 chủng vi khuẩn chọn lọc, chúng tôi đê sử dụng 100 mồi để khảo sât tính đa hình của 3 chủng vi khuẩn chọn đại diện từ 19