4. Ý NGHĨA KHOA HỌC VA THỰC TIỄN
2.3.3. Phương pháp phân tích một số chỉ tiêu vi sinh vật
2.3.3.1. Phương pháp xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí trên thịt: TCVN 7136: 2002
* Nguyên tắc
Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn sinh trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có sự hiện diện của oxy phân tử. Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm. Chỉ số này được xác định bằng cách sử dụng kỹ thuật đổ đĩa trên cơ sở số lượng mẫu đã xác định và xem một khuẩn lạc là sinh khối phát triển từ một tế bào hiện diện trong mẫu.
Đếm số khuẩn lạc đã mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng từ các nồng độ pha loãng khác nhau, sau khi nuôi cấy ở 370C trong 24 - 48 giờ.
Số khuẩn lạc được tính trong 1g hay 1ml mẫu.
Bước 1: lấy mẫu theo QCVN 01 – 04: 2009 Bước 2: đồng nhất mẫu và pha loãng
Đồng nhất mẫu:
Cân 1g thịt cho vào cối đã được tiệt trùng. Sau đó cho thêm vào 9ml dung dịch đệm pepton, tiến hành nghiền nhỏ thịt, ta thu được độ pha loãng 10-1.
Pha loãng mẫu:
Chuẩn bị các ống eppendorf và các micropipette vô trùng. Dịch mẫu đồng nhất được tiếp tục pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng micropipette với đầu tuýp vô trùng hút 0,1ml dịch mẫu 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 0,9ml dung dịch đệm pepton, trộn đều mẫu trong ống nghiệm cho đồng nhất bằng máy rung (vortex) ta có được độ pha loãng 10-2, tương tự ta lấy 0,1ml dịch mẫu 10-2 cho vào ống nghiệm chứa 0,9ml dung dịch đệm pepton đã chuẩn bị sẵn ta có độ pha loãng 10-3. Cứ tiếp tục như vậy ta sẽ có các nồng độ 10-4, 10-5.
Lưu ý khi pha loãng mẫu:
Nồng độ pha loãng phụ thuộc vào tình trạng vệ sinh của bệnh phẩm, thời gian bảo quản, điều kiện bảo quản, kinh nghiệm người tiến hành thí nghiệm.
Tiến hành thao tác bên ngọn lửa đèn cồn. Các ống nghiệm phải tuyệt đối vô trùng. Sử dụng 1 micropipet 1ml cho 1 nồng độ pha loãng mẫu tránh hiện tượng sai số.
Mỗi lần lấy mẫu phải lắc đều.
Tất cả thao tác phải tiến hành trong điều kiện vô trùng. Bước 3: Cấy mẫu
Đổ môi trường thạch dinh dưỡng PCA đã hấp vô trùng, để nguội 410C, trộn đều bằng cách xoay ngược chiều nhiều lần nhẹ nhàng rồi để các đĩa đông tự nhiên. Dùng micropipet với đầu típ vô trùng hút 0,1ml mẫu ở các nồng độ pha loãng cho vào đĩa petri dàn đều bằng que cấy pasteur. Úp ngược đĩa và ủ ở 36 - 380C trong 24 - 48 giờ. Mỗi nồng độ cấy vào 2 đĩa peptri.
Bước 4: Đọc kết quả
Sau 24 giờ nuôi cấy thì ta tính kết quả sơ bộ bằng cách đếm khuẩn lạc trên đĩa nuôi cấy. Chỉ tính kết quả khi sự phân bố khuẩn lạc trên các đĩa là hợp lý với mối tương quan giữa độ pha loãng và số khuẩn lạc mọc trên đó (Francis and O’Beirne, 2002).
Chọn các đĩa có số khuẩn lạc từ 30 – 300 để tính kết quả.
X= C (n1 + 0,1n2) dV
Trong đó:
C - tổng số khuẩn lạc của các đĩa ở hai độ pha loãng được đếm n1 - số đĩa được đếm ở độ pha loãng thứ nhất
n2 - số đĩa được đếm ở độ pha loãng thứ hai d - hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ nhất
V- thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa (trong thí nghiệm, V = 1)
2.3.3.2. Phương pháp xác định và tính sốlượng Enterobacteriaceae: TCVN 5518- 2:2007
* Nguyên tắc
Mẫu đã được đồng nhất hóa được cấy một lượng nhất định lên môi trường thạch chọn lọc thích hợp chứa lactose, ủ ở 370C trong 24 giờ, đếm các khuẩn lạc có hình dạng đặc trưng.
* Các bước tiến hành
Bước 1: Lấy mẫu theo QCVN 01 – 04: 2009 Bước 2: Đồng nhất mẫu và pha loãng
Đồng nhất mẫu:
Cân 1g thịt cho vào cối đã được tiệt trùng. Sau đó cho thêm vào dung dịch đệm pepton, tiến hành giã nhỏ thịt, ta thu được độ pha loãng 10-1.
Pha loãng mẫu:
Chuẩn bị các ống eppendorf và các micropipette vô trùng. Dịch mẫu đồng nhất được tiếp tục pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng micropipette với đầu tuýp vô trùng hút 0,1ml dịch mẫu 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 0,9ml dung dịch đệm pepton, trộn đều mẫu trong ống nghiệm cho đồng nhất bằng máy rung (vortex) ta có được độ pha loãng 10-2, tương tự ta lấy 0,1ml dịch mẫu 10-2 cho vào ống nghiệm chứa 0,9ml dung dịch đệm pepton đã chuẩn bị sẵn ta có độ pha loãng 10-3. Cứ tiếp tục như vậy ta sẽ có các nồng độ 10-4, 10-5, 10-6....
Bước 3: Nuôi cấy dịch mẫu
Đổ môi trường thạch dinh dưỡng Eosin Methylene Blue (EMB) đã hấp vô trùng, để nguội 450C, trộn đều bằng cách xoay ngược chiều nhiều lần nhẹ nhàng rồi đổ ra đĩa petri, mỗi đĩa từ 12 -15ml, sau đó để các đĩa đông tự nhiên.
Chọn 2 độ pha loãng liên tiếp, dùng micropipet với đầu típ vô trùng hút 0,1ml dịch mẫu ở các nồng độ pha loãng cho vào đĩa petri. Tương ứng với mỗi độ pha loãng
cấy lên 2 đĩa petri. Sau khi hút dịch mẫu ra môi trường thì dùng que dàn, dàn mẫu để mẫu phân tán đều vào môi trường, lật ngược đĩa và để vào tủ ấm ở 36 – 380C trong 24 - 48 giờ.
Quá trình phân tích chỉ tiêu Enterobacteriaceae theo TCVN 5518-2:2007
Bước 4: Đọc kết quả
Sau 24 giờ nuôi cấy mang ra đọc kết quả. Khuẩn lạc của vi khuẩn
Enterobacteriaceae trên môi trường EMB có màu tím ánh kim. Chỉ tính kết quả khi sự phân bố khuẩn lạc trên các đĩa là hợp lý với mối tương quan giữa độ pha loãng và số khuẩn lạc mọc trên đó.
Trên môi trường EMB khuẩn lạc có dạng sau:
Escherichia coli: Khuẩn lạc màu tím đen, lồi, hơi dày, đường kính 2-3 mm với
tâm đen chiếm hơn 3/4 đường kính và có ánh kim hơi lục trong ánh sáng phản chiếu.
Enterobacter aerogenes: Khuẩn lạc màu xanh, tương đối dày, đường kính 4 – 6
mm với tâm màu nâu đen, đôi khi có ánh kim.
Citrobacter: Khuẩn lạc màu tím với chút ánh kim. Klebsiella: Khuẩn lạc màu nâu nhầy.
Salmonella và Shigella: Khuẩn lạc màu hổ phách trong suốt.
Chọn các đĩa có số khuẩn lạc từ 30 – 300 để tính kết quả.
Số vi khuẩn Enterobacteriaceae trong 1g thịt được tính theo công thức sau:
X = C
(n1 + 0,1n2) dV
Trong đó:
C - tổng số khuẩn lạc của các đĩa ở hai độ pha loãng được đếm n1 - số đĩa được đếm ở độ pha loãng thứ nhất
n2 - số đĩa được đếm ở độ pha loãng thứ hai d - hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ nhất.
V- thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa (trong thí nghiệm, V = 1)
2.3.3.3. Phương pháp phát hiện Salmonella
* Nguyên tắc
Salmonella có thể được phát hiện (phân tích định tính) bằng một quy trình gồm
4 bước là tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định Salmonella thường có mặt trong mẫu với số lượng nhỏ, và cùng hiện diện chung với một số lượng lớn các vi
khuẩn khác thuộc họ Enterobateriaceae có tính cạnh tranh mạnh và ức chế sự tăng trưởng của Salmonella.
Đếm số khuẩn lạc đã mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng từ các nồng độ pha loãng khác nhau, sau khi nuôi cấy ở 37oC trong 24 giờ.
* Các bước tiến hành
Bước 1: Lấy mẫu theo QCVN 01 – 04: 2009 Bước 2: Đồng nhất mẫu và pha loãng
Cân 25g thực phẩm (thịt tươi) cho vào cối đã được tiệt trùng. Sau đó cho thêm vào 225ml dung dịch đệm Peptone, tiến hành giã nhỏ thịt, ta thu được độ pha loãng 10-1.
Chuẩn bị các ống eppendorf và các micropipette vô trùng. Dịch mẫu pha loãng được tiếp tục pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng micropipet với đầu vô trùng chuyển 0,1ml dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 0,9ml dung dịch đệm, trộn đều mẫu trong ống nghiệm cho đồng nhất bằng máy trộn (vortex) ta có được độ pha loãng 10-2.
Tiếp tục thực hiện tương tự để có độ pha loãng cần thiết.
Bước 3: Nuôi cấy mẫu
Dùng micropipet với đầu vô trùng hút 1ml mẫu ở nồng độ pha loãng 10-1 cho vào môi trường canh thang. Lắc nhẹ nhiều lần để mẫu phân tán đều vào môi trường, bỏ vào tủ ấm ở 37oC trong 24 giờ.
Đổ môi trường thạch dinh dưỡng Salmonella- Shigella Agar (SS agar) đã hấp vô trùng, để nguội 450C, trộn đều bằng cách xoay ngược chiều nhiều lần nhẹ nhàng rồi để các đĩa đông tự nhiên.
Dùng micropipet với đầu típ vô trùng hút 0,1ml mẫu ở các nồng độ pha loãng cho vào đĩa petri. Dùng que dàn, dàn mẫu để mẫu phân tán đều vào môi trường, lật ngược đĩa và ủ ở 370C trong 24 – 48 giờ.
Sau 24 giờ đọc kết quả, dùng que cấy bắt những khuẩn lạc nghi ngờ để thực hiện kỹ thuật cấy thuần.
Bước 4: Đọc kết quả
Sau 24 - 48 giờ mang các đĩa petri đã cấy vi khuẩn ra đọc kết quả. Khuẩn lạc của vi khuẩn Salmonella trên môi trường thạch SS agar có tâm màu đen, viền màu hồng Quy trình kiểm nghiệm này chỉ cho phép phân tích định tính Salmonella, giúp kết luận có hay không có Salmonella hiện diện trong 25g mẫu, không cho phép phân biệt được các dòng Salmonella hiện diện trong mẫu.
2.3.3.4. Phương pháp MPN (Most Probable Number)
* Nguyên tắc:
Phương pháp MPN (phương pháp có số xác suất cao nhất, số tối khả) còn được gọi là phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ.
Đây là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loại thí nghiệm được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau. Thông thường, việc định lượng này được thực hiện lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng 3 x 3 = 9 ống nghiệm.
Dựa vào kết quả biểu kiến chứng minh sự tăng trưởng của vi sinh vật cần kiểm định trong từng ống nghiệm (hiện tượng sinh hơi, đổi màu, đục…), ghi nhận số lượng các ống nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng.
Sử dụng số liệu này và dựa vào bảng Mac Crady suy ra mật độ vi sinh vật được trình bày dưới dạng số MPN/100 ml hay MPN/1 g mẫu.
* Cách tiến hành:
Bước 1: Lấy mẫu và pha loãng mẫu đến 3 nồng độ liên tiếp thích hợp.
Bước 2: Mỗi độ pha loãng hút 3 lần, mỗi lần 1 ml cấy vào 3 ống nghiệm môi trường Lauryl Sulphate Broth (LSB). Hút 3 nồng độ liên tiếp, mỗi nồng độ 3 ống nghiệm.
Bước 3: Ủ ấm từ 35 – 370C, thời gian 24 – 48 giờ
Bước 4: Ống dương tính là ống có bọt khí trong ống durham
Bước 5: Tra bảng Mac Crady – loạt 3 ống nghiệm ở 3 nồng độ liên tiếp
Bảng MPN/100 ml tính theo lượng mẫu là 10 ml, 1ml và 0,1 ml tương đương MPN/ml của mẫu đã pha loãng 10-1, 10-2, 10-3 dùng phân tích.
Kết quả tra bảng MPN/ml = kết quả tra bảng x f/10 (f: độ pha loãng thấp nhất 10n)
Các ống nghiệm đã cấy mẫu nuôi ở nhiệt độ 370C trong 48 giờ. Ghi nhận ống có phản ứng dương tính với hiện tượng sinh khí và mờ đục ống nghiệm. Khẳng định sự có mặt của vi khuẩn Coliform bằng cách cấy chuyển dịch mẫu từ các ống Lauryl Sulphate Broth (LSB) (+) sang các ống chứa canh thang Brilliant Green Bile Lactose (BGBL) và nuôi ở nhiệt độ 370C trong thời gian 48 giờ. Đồng thời cấy chuyển từ các ống Lauryl Sulphate Broth (LSB) (+) trên sang các ống EC Broth, nuôi trong 24 giờ ở nhiệt độ 44,50C nhằm khẳng định sự có mặt của E. Coli hoặc Coliform chịu nhiệt.