2. Mục tiêu nghiên cứu
2.3.4. Phương pháp nhân giống invitro cây Sói rừng
2.3.4.1. Phương pháp khử trùng mẫu tạo vật liệu vô trùng
Phương pháp khử trùng mẫu cấy: Mẫu đoạn thân được rửa và loại bớt những bộ phận không cần thiết dưới vòi nước chảy. Sau đó mẫu được ngâm trong nước xà phòng loãng 5 phút. Tiếp tục rửa mẫu dưới vòi nước chảy sao cho sạch hết bụi bẩn và xà phòng. Tráng mẫu bằng nước cất vô trùng 3 lần trước khi đem vào tủ cấy để tiến hành khử trùng. Trong tủ cấy, mẫu được lắc với cồn 70% trong 60 giây, sau đó tráng nước cất vô trùng 3 lần. Mẫu sau đó được khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% với khoảng thời gian khác nhau: 5 phút, 10 phút, 15 phút, 20 phút.
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% đến khả năng tạo mẫu vô trùng
Dùng pank gắp từng đoạn thân đã khử trùng đặt trên bề mặt giấy thấm.
Thao tác cắt từng đoạn mẫu có ít nhất 1 mắt ngủ. Loại bỏ phần gốc ở từng đoạn thân để hóa chất khử trùng không ngấm sâu vào mẫu vật.
Mẫu được cấy vào môi trường nuôi cấy theo hướng thẳng đứng.
Công thức được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 30 mẫu.
Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm. Thời gian theo dõi 4 tuần.
2.3.4.2. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi Sói rừng
Thí nghiệm 2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân nhanh chồi Sói rừng
Cách tiến hành: Mẫu sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường nuôi cấy khởi đầu sẽ cấy sang môi trường MS có bổ sung BAP với dãy nồng độ: 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 3 mg/l. Nồng độ BAP cho hệ số nhân cao nhất sẽ dùng cho thí nghiệm 3.
26
được cấy thẳng đứng, cấy 4 – 5 chồi/bình (bình thể tích 250ml). Giá trị pH của môi trường cấy là 5,6 – 5,8.
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP kết hợp Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Sói rừng
Môi trường MS + nồng độ BAP thích hợp trong thí nghiệm 2 được bổ sung thêm kinetin theo dãy nồng độ: 0, 0,2; 0,6; 0,8; 1,0 mg/l.
Cách tiến hành: Lựa chọn chồi có chiều cao 2- 3 cm sau giai đoạn tái sinh, cắt chồi và xiết chồi đỉnh sau đó cấy vào môi trường nhân nhanh tạo cụm chồi nghiên cứu. Chồi được cấy thẳng đứng, cấy 4 – 5 chồi/bình (bình thể tích 250ml). Giá trị pH của môi trường cấy là 5,6 – 5,8.
Thí nghiệm 4: Kết quảảnh hưởng của tổ hợp BAP và Kinetin với NAA đến khả năng nhân nhanh chồi Sói rừng
Môi trường MS + đường và agar + nồng độ BAP thích hợp trong thí nghiệm 2 kết hợp nồng độ kinetin thích hợp trong thí nghiệm 3 được bổ sung thêm auxin NAA theo dãy nồng độ: 0, 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 mg/l.
Các thí nghiệm 2,3,4 được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 30 mẫu. Chỉ tiêu theo dõi: hệ số nhân chồi. Thời gian theo dõi qua mỗi lần cấy chuyển là 4 tuần.
Thí nghiệm 5: Kết quảảnh hưởng của tổ hợp BAP và Kinetin với IBA đến khả năng nhân nhanh chồi Sói rừng
Sử dụng môi trường nền MS + nồng độ BAP thích hợp nhất trong thí nghiệm 2 kết hợp nồng độ Kinetin tối ưu nhất trong thí nghiệm 3 được bổ sung thêm auxin IBA theo dãy nồng độ: 0, 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 mg/l.
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 30 mẫu. Chỉ tiêu theo dõi: hệ số nhân chồi. Thời gian theo dõi qua mỗi lần cấy chuyển là 4 tuần.
27
Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng NAA đến khả năng ra rễ chồi Sói rừng
Các chồi Sói rừng đạt tiêu chuẩn, chiều cao ≥ 2 cm, cây thẳng, cứng cáp, có từ 3-4 lá được cấy chuyển sang môi trường MS có bổ sung các chất NAA với dãy nồng độ: 0; 0,5 mg/l; 1,0 mg/l; 1,5 mg/l; 2,0 mg/l.
Dùng dao tách riêng từng chồi, cắt tỉa bớt lá già, lá vàng.
Chồi Đinh lăng được cấy theo hướng thẳng đứng vào môi trường tạo rễ với số lượng 20 chồi/ bình (bình trụ thể tích 250 ml).
Giá trị pH của môi trường nuôi cấy là 5,6 - 5,8.
Thời gian xuất hiện rễ từ 2 - 3 tuần sau khi cấy chồi vào môi trường tạo rễ. Thời gian theo dõi sau 4 tuần. Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại. Mỗi lần nhắc lại 30 mẫu.
Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng IBA đến khả năng ra rễ chồi Sói rừng
Chồi Sói rừng hữu hiệu được cấy chuyển sang môi trường MS có bổ sung các chất IBA với dãy nồng độ: 0; 0,5 mg/l; 1,0 mg/l; 1,5 mg/l; 2,0 mg/l.
Chỉ tiêu theo dõi: tỉ lệ ra rễ, số rễ, chất lượng rễ. Thời gian theo dõi sau 4 tuần. Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại. Mỗi lần nhắc lại 30 mẫu.
Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của loại giá thể đến tỷ lệ sống cây Sói rừng giai đoạn sau in vitro
Để cây con sau giai đoạn in vitro tại vườn ươm có tỷ lệ sống cao, sinh trưởng và phát triển tốt, cần cảm ứng cây trước ra ngôi như sau:
Bình Sói rừng sau khi ra rễ sẽ được đưa ra nhà lưới cảm ứng với điều kiện bên ngoài 7-10 ngày để cây con thích nghi dần với ánh sáng tự nhiên. Sau đó rửa sạch, để ráo nước và tiến hành cấy lên các loại giá thể: Đất (ĐC); Đất + Trấu hun (7:3); ½ Đất + ¼ trấu hun+ ¼ xơ dừa. Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ sống, biến động chiều cao. Thời gian theo dõi sau 90 ngày. Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại. Mỗi lần nhắc lại 30 mẫu.
* Điều kiện thí nghiệm:
28
tiến hành trong điều kiện nhân tạo. Ánh sáng, nhiệt độ và độ ẩm duy trì như sau: - Ánh sáng: mẫu được nuôi cấy duới ánh đèn neon với cường độ ánh sáng từ 2000- 25000 lux, thời gian chiếu sáng 8 - 10h/ngày.
- Nhiệt độ: nhiệt độ trong phòng duy trì 250C ± 20C. - Độ ẩm thường xuyên duy trì 60 – 70%.
2.3.4.3. Phương pháp đánh giá
- Các chỉ tiêu theo dõi sẽđược tính toán theo các công thức sau:
Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%) = Ʃ mẫu sống không nhiễm (mẫu) × 100 Ʃ mẫu cấy (mẫu)
Hệ số nhân chồi (lần) = Ʃ chồi thu được (chồi) Ʃ chồi cấy ban đầu (chồi)
Tỷ lệ ra rễ = Ʃ số mẫu có rễ (mẫu) x 100 Ʃ số mẫu cấy (mẫu)
Số rễ (rễ/chồi) = Ʃ số rễ (rễ) Ʃ số chồi (chồi)
Tỷ lệ sống (%) = Ʃ số cây sống (cây) x 100 Ʃ số cây trồng (cây)
Chiều cao TB (cm) = Ʃ chiều cao mẫu theo dõi (cm) Ʃ mẫu theo dõi (mẫu)