2. Mục tiêu nghiên cứu
3.4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh đến
ra rễ chồi Sói rừng
3.4.4.1. Kết quảảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của chồi Sói rừng
Ra rễ là bước cuối cùng của gian đoạn nhân giống in vitro. Chất kích thích sinh trưởng được dùng chủ yếu của giai đoạn này thuộc nhóm auxin. Các chồi tạo
56
thành đạt tiêu chuẩn sẽ được tách ra đưa vào mỗi trường kích thích tạo rễ. Môi trường ra rễ được bổ sung với các hàm lượng NAA khác nhau. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng NAA đến khả năng ra rễ của chồi Sói rừng được thể hiện ở bảng 3.16.
Bảng 3.16. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của chồi Sói rừng (sau 4 tuần nuôi cấy) Công thức (CT) Nông độ NAA (mg/l) Tổng số mẫu (mẫu) Tỷ lệ ra rễ (%) Số rễ trung bình trên cây (rễ) Hình thái và chiều dài rễ CT 1 0 90 6,66 0,76 Rễ mảnh, dài, vàng CT 2 0,25 90 91,11 1,84 Rễ mảnh, dài, vàng CT 3 0,5 90 100 3,05 Rễ mảnh, dài, vàng CT 4 0,75 90 100 2,62 Rễ mảnh, dài, vàng CT 5 1,0 90 82,22 2,78 Rễ mảnh, dài, vàng LSD0,05 0,1 CV% 1,7
Kết quả phân tích cho giá trị LSD0,05=0,1, CV%=1,7 cho thấy số rễ trung bình ở các công thức khác nhau có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%.
Để thiết lập môi trường thích hợp cho tạo rễ, chúng tôi đã sử dụng 5 công thức khác nhau, bổ sung NAA (0 - 1 mg/l). Ở công thức CT1 (đối chứng) không bổ sung NAA tỷ lệ ra rễ và số rễ tương ứng 6,66 và 0,76 điều này cho thấy auxin nội sinh có trong mẫu ít nên việc hình thành rễ in vitro trên đối tượng này không cao. Khi bổ sung NAA 0,25 mg/l ở CT2 tỷ lệ tạo rễ tăng lên đạt 91,11% tương ứng số rễ 1,84. Hiệu quả thí nghiệm cao nhất ở CT3 và CT4 với nồng độ NAA 0.5 mg/l và 0,75 mg/l tương ứng tỷ lệ ra rễ đạt 100%, số rễ hình thành 3,05 rễ và 2,62 rễ. Khi nồng độ NAA vượt qua ngưỡng tối thích ở CT3 (0,5 mg/l) thì số rễ có xu hướng giảm dần. Kết quả này thích hợp với lý thuyết về sự tác động của auxin lên sự hình thành và phát triển của rễ. Các nhà nghiên cứu cho rằng nồng độ auxin quá cao có tác động ngăn cản sự phát triển của rễ (De Klerk, 1999).
57
CT1 (ĐC): NAA 0,0 mg/l CT3: NAA 0,5 mg/l
Hình 3.14. Ảnh hưởng của NAA đến kết quả ra rễ chồi Sói rừng
3.4.4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng ra rễ của chồi Sói rừng
Bảng 3.17. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ IBAđến khả năng ra rễ của chồi Sói rừng (sau 4 tuần nuôi cấy)
Công thức (CT) Nông độ IBA (mg/l) Tổng số mẫu (mẫu) Tỷ lệ ra rễ (%) Số rễ trên cây (rễ) Hình thái và chiều dài rễ CT 1 0 90 6,66 0,76 Rễ mập, ngắn CT 2 0,25 90 100 5,67 Rễ mập, ngắn CT 3 0,5 90 100 6,15 Rễ mập, ngắn CT 4 0,75 90 100 5,96 Rễ mập, ngắn CT 5 1,0 90 100 3,61 Rễ mập, ngắn LSD0,05 0,18 CV% 1,7
Cùng với NAA, IBA là chất điều hòa sinh trưởng tổng hợp điển hình của nhóm auxin. Chúng tôi tiếp tục tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ chồi Sói rừng in vitro. Tương tự như thí ngiệm NAA, IBA được đưa vào
58
môi trường với nồng độ 0 - 1,0 mg/l. Kết quả thí nghiệm sau 4 tuần nuôi cấy được trình bày trong bảng 3.17.
Kết quả phân tích cho giá trị LSD0,05=0,18, CV%=1,7 cho thấy số rễ trung bình ở các công thức khác nhau có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%.
Kết quả bảng 3.17 cho thấy: Khi bổ sung IBA vào môi trường thí nghiệm cho kết 100% có sự đáp ứng tạo rễ in vitro. Tuy nhiên số lượng rễ hình thành/mẫu cấy ở các nồng độ khác nhau là khác nhau.
Trong môi trường ra rễ chứa IBA, rễ xuất hiện sau 7 - 10 ngày nuôi cấy chồi trong môi trường. Tỷ lệ chồi ra rễ tăng dần và tỷ lệ với nồng độ IBA và đạt cao nhất là 100%, số rễ trung bình là 4,15 ở nồng độ IBA (0,5 mg/l). Sau đó, tỷ lệ ra rễ giảm dần ở nồng độ IBA 0,75 - 1,0 mg/l. Trong môi trường bổ sung IBA (0,25 - 1,0 mg/l) tỷ lệ chồi ra rễ đều cao hơn so với môi trường đối bổ sung NAA (0,25 - 1,0 mg/l).
So sánh giữa các môi trường nuôi cấy có IBA và NAA, chúng tôi nhận thấy các môi trường có bổ sung NAA đều cho kết quả (số lượng rễ hình thành) kém hơn so với các môi trường tương ứng có bổ sung IBA ở cùng nồng độ. Chứng tỏ IBA là chất kích thích tạo rễ thích hợp hơn cho nuôi cấy tạo rễ in vitro
cây Sói rừng. Nồng độ IBA tối ưu là 0,5 mg/lIBA cho số rễ trung bình đạt 6,15 rễ/chồi. IBA cũng đã được chứng minh là auxin hiệu quả nhất cho việc giâm hom đối tượng này (Le Hong En, 2016).
CT1 (ĐC): IBA 0,0 mg/l CT3: IBA 0,5 mg/l
Hình 3.15. Ảnh hưởng của IBA đến kết quả ra rễ chồi Sói rừng 3.4.5. Nghiên cứu đưa cây ra nhà kính
Sau 4 tuần nuôi cấy, các bình chứa cây con in vitro đã ra rễ hoàn chỉnh được đưa ra cảm ứng với môi trường ngoài 10 - 15 ngày. Sau đó tiến hành rửa sạch môi trường, xếp gọn gàng trên rổ có lót báo ẩm để tránh cây bị gãy ỏng, mất nước. Ngâm cây
59
khoảng 3 phút trong dung dịch Ridomil (nồng độ 3g/l) để diệt trừ nấm bệnh trên cây, để ráo nước và cấy vào các bầu chứa giá thể đã chuẩn bị trước theo các công thức. Kết quả thể hiện ở bảng 3.18.
Bảng 3.18. Ảnh hưởng của một số loại giá thể đến tỷ lệ sống của cây Sói rừng in vitro sau 8 tuần theo dõi
Công thức Giá thể Tỷ lệ sống (%) Biến động chiều cao TB/cây (cm) CT1 Đất 100% 75,74 5,72 CT2 Đất + Trấu hun (7:3) 67,38 4,54 CT3 ½ Đất + ¼ trấu hun+ ¼ xơ dừa 90,74 7,06 LSD0.05 2,4 0,26 CV% 1,4 0,2
Cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện ổn định về dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, ẩm độ nên khi chuyển ra đất với các điều kiện hoàn toàn khác hẳn như dinh dưỡng thấp, ánh sáng cường độ mạnh, nhiệt độ cao, ẩm độ thấp nên cây con dễ bị stress, dễ mất nước và mau bị héo. Vì vậy Thí nghiệm được bố trí trong điều kiện độ ẩm, sánh sáng, có lưới che giảm nhiệt độ nên nhìn chung các công thức có tỷ lệ sống khá cao. Tỷ lệ dao động từ 75,74% đến 90,74%.
CT1: Đất CT2: Đất + Trấu hun (7:3) CT3: ½ Đất + ¼ trấu hun+ ¼ xơ dừa
60
Trong 3 công thức thí nghiệm, CT3: ½ Đất + ¼ trấu hun+ ¼ xơ dừa thích hợp hơn cho cây Sói rừng sau giai đoạn in vitro tương ứng tỷ lệ sống 90,74% qua 8 tuần theo dõi.
Chỉ tiêu về biến động chiều cao TB/cây (cm) là chỉ tiêu khách quan để đánh giá hiệu quả việc ra ngôi cây Sói rừng và sự phù hợp của giá thể sử dụng. CT3 cũng cho biến động chiều cao TB/cây đạt cao nhất. Như vậy khi ra ngôi cấy Sói rừng có thể sử dụng giá thể ½ Đất + ¼ trấu hun+ ¼ xơ dừa sẽ có tỷ lệ sống cao, đồng thời biến động chiều cao lớn.
Cho đến nay, một số nghiên cứu nhân giống cây Sói rừng đã được công bố. Ở Trung Quốc, S. glabra được nhân giống bằng giâm hom. Cây 2 năm tuổi cho tỷ lệ hom ra rễ đạt 88,7% sử dụng hom nhúng vào dung dịch 200mg/L ABT-1 trong 30 phút (Qiu, 2012; Zhu et al., 2010); 82% khi xử lý với dung dịch 200mg/L IBA (Liu et al., 2008) .
Zhu et al., (2010) đã nghiên cứu tạo rễ in vitro trên môi trường MS, kết quả NAA không có tác dụng cải thiện ra rễ. Môi trường tốt nhất cho ra rễ là 1/2MS+IBA 0.2 mg/L+sucrose30 g/L hoặc 1/4 MS+IBA 0.2 mg/L+sucrose 30 g/L.
Zhu et al., (2007) đã thu được mẫu cấy vô trùng bằng cách nhúng mẫu trong cồn 75% trong 30 giây, sau đó bằng HgCl2 0.1% trong 10 phút. Tiếp đó rửa bằng nước vô trùng và nhúng vào dung dịch 120 mg/l rifampicin trong 4 ngày; Cuối cùng mẫu được nhúng vào HgCl2 0.1% và rửa bằng nước vô trùng và cấy vào môi trường tái sinh chồi.
Le Hong En et al., (2016) đã nghiên cứu nhân giống Sói rừng bằng giâm hom. Tác giả đã sử dụng IBA, IAA, NAA để nghiên cứu tác dụng của chất kích thích ra rễ. Nồng độ IBA 1-1,5% cho ra rễ tốt nhất. Hom bánh tẻ cho ra rễ tốt hơn các loại hom khác. Bùi Văn Trọng và cs (2014) đã nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng tới sự hình thành rễ của hom cây Sói rừng (Sarcandra glaba (Thunb.) Nakai.) tại Lâm Đồng. Nhóm tác giả đã sử dụng NAA ở nồng độ 1% cho kết quả giâm hom Sói rừng tốt nhất đạt 86.67%, hom sống và ra rễ, số lượng rễ trung bình là 5.08 rễ/hom, chiều dài rễ trung bình là 3,68 cm so với đối chứng (66,67%; 3,9; 3,65 cm, tương ứng).
61
Kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước trên đây cho thấy, môi trường nhân nhanh chồi cho hệ số nhân chồi, môi trường tạo rễ cho tỷ lệ tạo rễ khác nhau trong các nghiên cứu đã công bố. Hầu hết, các tác giả nước ngoài không đề cập đến hiện tượng chồi bị thủy tinh thể khi tái sinh ban đầu trong môi trường có bổ sung BAP. Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng thích hợp tái sinh chồi. Trong nghiên cứu nhân giống cây Sói rừng chúng tôi thu được hệ số nhân giống đạt 5,99 lần trong thời gian 4 tuần nuôi cấy. Hiện nay các nghiên cứu về nhận giống In vitro cây Sói rừng còn hạn chế. Nghiên cứu của chúng tôi thay thế cho các quy trình nhận giống truyền thống, đáp ứng được yêu cầu về chất lượng và số lượng cây giống. Từ kết quả các bước nhân giống in vitro, chúng tôi đưa ra quy trình nhân giống cây Sói rừng như sau:
Bước 1. Chọn vật liệu khởi đầu cho nhân giống
Đoạn thân bánh tẻ của cây mẹ (2 năm tuổi) sinh trưởng khỏe, không biểu hiện sâu bệnh được thu thập và sử dụng để tái sinh chồi.
Bước 2. Khử trùng mẫu và tái sinh chồi
Chồi đỉnh của cây được thu thập từ vườn mẫu được rửa nhiều lần dưới vòi nước. Sau đó ngâm trong nước xà phòng loãng 10 phút và rửa loại bỏ xà phòng. Mẫu được khử trùng bằng cồn 70o trong 1 phút và rửa bằng nước cất vô trùng để loại bỏ cồn. Sau đó, mẫu tiếp tục được khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 5 phút, và rửa bằng nước cất vô trùng 3 lần để loại bỏ HgCl2. Đoạn thân được cắt bằng dao, panh cấy vô trùng và nuôi cấy trong bình nuôi cấy chứa môi trường tái sinh chồi MS + sucrose (30 g/l) + agar (10 g/l).
Bước 3. Giai đoạn nhân nhanh chồi
Chồi dài trên 0,5 cm từ môi trường tái sinh sau 4 tuần nuôi cấy được chuyển sang môi trường nhân nhanh chồi MS + sucrose (30 g/l) + agar (6 g/l) + BAP (1,5 mg/l) + kinetin (0,6 mg/l) + IBA (0,2 mg/l).
Bước 4. Tạo rễ và tái sinh cây hoàn chỉnh từ chồi.
Sau 4 tuần nuôi cấy, chồi dài trên 1,5 cm có trên 3 lá được cấy chuyển sang môi trường tạo rễ MS/2 + sucrose (15 g/l) + agar (6 g/l) + IBA (0,5 mg/l) + 0,1 g/l Than hoạt tính.
62
Bước 5. Chuyển cây ra nhà kính
Bình nuôi có cây hoàn chỉnh (hơn 3 rễ, 3 lá) được đưa ra cảm ứng với môi trường ngoài 10 – 15 ngày. Sau đó rửa loại bỏ môi trường nuôi cấy và cấy cây vào bầu đất chưa giá thể: 1/2Đất + ¼ Trấu hun + ¼ Xơ dưa.
Hình ảnh mô tả các bước nhân giống cây Sói rừng từ đoạn thân bánh tẻ được thể hiện ở hình 3.17.
A B
C D
Hình 3.17. Hình ảnh mô tả các bước nhận giống in vitro từ cây Sói rừng
A: Chồi Sói rừng tái sinh trong môi trường tái sinh.
B: Nhân nhanh chồi Sói rừng trong môi trường nhân nhanh. C: Tạo rễ cây hoàn chỉnh trong môi trường ra rễ.
D: Cây Sói rừng ra ngôi trong bầu chưa giá thể : 1/2Đất + ¼ Trấu hun + ¼ Xơ dừa ở nhà lưới.
63
Giá thành cây giống được tạo ra từ quy trình nhân giống in vitro sẽ cao hơn cây giống được tạo ra từ các biện pháp truyền thống (giâm hom, gieo hạt), tuy nhiên sự dụng quy trình nhận giống in vitro đem lại hiệu quả kinh tế cao hơn vì có thể sản xuất cây giống với số lượng lớn, đống nhất, mang các đặc tính tốt, đảm bảo chất lượng cây giống.
64
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1.Kết luận
- Điều tra thu thập được 15 mẫu Sói rừng thuộc 5 huyện: Xín Mần, Mèo vạc, Quản bạ, Hoàng Su Phì và Vị Xuyên của tỉnh Hà Giang.
- Đánh giá sơ bộ về đặc điểm hình thái 15 mẫu thu thập được là cây Sói rừng:
Các mẫu thu thập
Chỉ tiêu theo dõi về hình thái
Thân Lá Hoa Quả
Thân phân nhánh, có màu lục, thân hình trụ Lá mặt trên xanh thẫm, mặt dưới xanh nhạt, mép lá có răng cưa, phiến lá hình bầu dục Bông kép, ít nhánh, nhánh ngắn với hoa nhỏ màu
trắng không có cuống và có một nhị Quả nhỏ, hình hơi tròn, chưa chín có màu xanh, quả chín có màu đỏ gạch. Hình ảnh
- Đã giải trình tự và xác định được 15 đoạn trình tự của 15 mẫu lá Sói rừng được thu thập từ 15 xã của 05 huyện thuộc tỉnh Hà Giang có hệ số tương đồng về trình tự nucleotide với mẫu tham chiếu Chloranthus erectus dao động từ 59,21% (mẫu SR11 và Chloranthus erectus) đến 90,82% (mẫu SR2, SR3 và Chloranthus erectus). 15 mẫu Sói rừng có hệ số tương đồng về trình tự nucleotide với mẫu tham
65
chiếu Sarcandra glabra dao động từ 66,17% (mẫu SR10 và Sarcandra glabra) đến 99,46% (mẫu SR8; SR9 và Sarcandra glabra).
- Quy trình nhân giống cây Sói rừng bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào từ đoạn thân bánh tẻ của cây 2 năm tuổi đã được thiết lập. Khử trùng mẫu trong dung dịch HgCl2 (0,1%) trong 5 phút, tỷ lệ mẫu mẫu sống không nhiễm đạt 62,2%. Tái sinh chồi trong mồi trường MS không chứa chất điều hòa sinh trưởng. Nhân nhanh chồi trong môi trường MS + BA (1,5 mg/l) + kinetin (0,6 mg/l) + IBA (0,2 mg/l) + sucrose (30 g/l). Hệ số nhân chồi đạt 5,99 lần sau 4 tuần nuôi cấy. Tái sinh rễ cây hoàn chỉnh trong môi trường MS/2 + IBA (0,5 mg/l) + than hoạt tính (0,1 g/l) + sucrose (15 g/l). Tỷ lệ chồi tạo rễ đạt 100% sau 4 tuần nuôi cấy. Cây hoàn chỉnh được trồng trong bầu chứa ½ Đất + ¼ trấu hun+ ¼ xơ dừa. Tỷ lệ cây sống đạt 90,74%, biến động chiều cao đạt 7,06 cm sau 8 tuần nuôi trồng.
2. Kiến nghị
Đề nghị nghiên cứu đồng thời ảnh hưởng của nhiều yếu tố đến hiệu quả thí nghiệm trong quy trình nhận giống
Đề nghị Quy trình nhân giống cây Sói rừng bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào đã xây dựng có thể áp dụng để nhân nhanh, sản xuất cây giống chất lượng cao phục vụ sản xuất.
66
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Nguyễn Quỳnh Anh (2013), “Nghiên cứu ứng dụng cây Sói rừng (Sarcandra GlaBra (Thunb) Nakai) ở Cao Bằng để hỗ trợ điều trị một số bệnh ung thư”, Khoa học và công nghệ Cao Bằng.
2. Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn (2013), Đề án quy hoạch phát triển cây dược liệu toàn quốc đến năm 2020, tầm nhìn 2030.
3. Đỗ Huy Bích (2011), Cây thuốc và Động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập III, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
4. Võ Văn Chi (2012), Từ điển cây thuốc Việt Nam (Bộ mới), tập II, NXB Y học, Hà Nội
5. Võ Văn Chi (1996), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nxb Y học, Hà Nội.
6. Vũ Văn Dũng, Nguyễn Ngọc Chính (1994), Báo cáo các nhóm cây Lâm sản ngoài gỗ của miền Bắc Việt Nam, Tài liệu Viện Điều tra Quy hoạch rừng.
7. Nguyễn Quang Hưng (2008). Nghiên cứu đánh giá thực trạng gây trồng một số loài cây Lâm sản ngoài gỗ chủ yếu ở vùng núi phía bắc làm cơ sở đề xuất các giải pháp phát triển bền vững, luận văn Thạc sĩ, ĐH Lâm nghiệp 2008.
8. Phạm Hoàng Hộ (2006), Cây có vị thuốc ở Việt Nam, Nhà xuất bản Trẻ.
9. Mai Hoàng Oanh (2016), Nghiên cứu đặc điểm hình thái và xác định một số trình tự gen phân bố cây Sói rừng (Sarcandra Glabra (Thunb.) Nakai), Luận văn Thạc sỹ Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Khoa học.
10. Bùi Văn Trọng, Nguyễn Cao Xuân Viên, Nguyễn Thanh Nguyên (2014), “Ảnh