2. Mục tiêu nghiên cứu
1.4.5. Các giai đoạn trong nhân giống invitro
1.4.5.1. Khử trùng mô nuôi cấy
Là giai đoạn quan trọng, quyết định đến kết quả của quá trình nuôi cấy. Mục đích của giai đoạn này là tạo nguồn nguyên liệu vô trùng để đưa vào nuôi cấy. Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc vào cách lấy mẫu, nồng độ và thời gian khử trùng.
1.4.5.2. Tái sinh mẫu
Mục đích của giai đoạn này là tái sinh có định hướng sự phát triển của mô nuôi cấy. Quá trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỷ lệ các hợp chất điều hòa sinh trưởng như auxin/cytokinin đưa vào môi trường nuôi cấy cũng như tuổi sinh lý của mẫu.
1.4.5.3. Nhân nhanh
Là giai đoạn bao gồm nhiều lần cấy chuyển mô trên các môi trường nhân nhanh nhằm kích thích tạo các cơ quan phụ hoặc các cấu trúc khác mà từ đó cây con hoàn chỉnh có thể tái sinh. Mục đích của giai đoạn này là tạo hệ số nhân cao nhất. Để đạt được mục đích nhân nhanh, người ta thường đưa vào môi trường nuôi cấy các
16
chất điều hòa sinh trưởng (auxin, cytokinin, gibberellin…) hoặc các chất hữu cơ (nước dừa, dịch chiết nấm men, …) kết hợp với các yếu tố môi trường (nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm…)
- Tạo cây con hoàn chỉnh
Khi đạt được kích thước nhất định, các chồi được chuyển qua môi trường tạo rễ, hình thành cây con hoàn chỉnh, giai đoạn này môi trường nuôi cấy chủ yếu được bổ sung thêm auxin giúp tạo rễ cho cây con.
- Ra cây
Cây con nuôi cấy trong phòng thí nghiệm có đầy đủ các bộ phận (thân, lá, rễ) khỏa mạnh và không bị nhiễm sẽ đưa ra môi trường bên ngoài, trong điều kiện thực tiễn sản xuất, đây là giai đoạn đưa cây từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng hoàn toàn.
1.4.5.4. Giai đoạn huấn luyện và đưa cây con ra môi trường thực tiễn sản xuất
Cây con trong ống nghiệm được sản xuất dưới điều kiện lý tưởng (nhân tạo) về nhiệt độ, ánh sáng và môi trường dinh dưỡng. Để cấy cây ra bầu đất với tỷ lệ sống cao cần phải huấn luyện cây cho cứng cáp trước khi cho ra khỏi ống nghiệm. Cây được huấn luyện bằng cách đặt ống nghiệm (bình cây) trong điều kiện ánh sáng và nhiệt độ tự nhiên với cường độ ánh sáng từ 5000 - 10.000 lux, nếu lớn hơn 10.000 lux cần phải che bớt lượng ánh sáng. Thời gian huấn luyện khoảng 6 - 8 ngày để cây con quen dần với điều kiện tự nhiên. Khi thân chuyển sang mầu của tự nhiên, lá xoè ra đầy đủ thì có thể tiến hành cấy chuyển vào bầu đất.
Chú ý: Không nên kéo dài thời gian huấn luyện vì để lâu rễ bị đen, lá úa vàng, khi đó tỷ lệ sống khi cấy vào bầu đất hoặc luống đất sẽ không cao.
Ra ngôi:
- Tạo dung dịch hồ rễ. Trước khi hồ rễ ít 12 giờ, trộn đất tầng B với dung dịch thuốc tím 0,1 %. Khi dùng rửa thuốc tím bằng nước sạch từ 3 - 4 lần và tạo cho đất ở dạng hồ loãng để hồ rễ cây, Tỷ lệ 1 đất 1 nước - Tạo bầu: Bầu được làm bằng nhựa PE có đường kính và chiều cao tùy theo từng loài cây, thông thường sử dụng các loại bầu có đường kính 5 - 6 cm, cao 11 cm không có đáy hoặc có đáy thì phải đục lỗ ở đáy hoặc xung quanh để thoát nước. Thành phần ruột bầu: Dùng đất tầng B đập nhỏ, sàng bỏ rễ cây và các tạp chất khác.
17
- Xử lý bầu, luống đất: Trước khi cấy cây 12 - 24 giờ, đất phải được xử lý bằng dung dịch thuốc tím 0,1% (hoà thuốc tím vào nước và dùng ô doa tưới đều lên bề mặt đất cho thấm sâu 1,5 - 2 cm. Vào mùa nguy cơ nấm bệnh cao nồng độ thuốc tím phải cao hơn 0,2 - 0,3%.
- Thao tác ra ngôi: Lấy cây mầm từ trong lọ ra bằng cách đổ ra lòng bàn tay, nhặt từng cây một cho ra khỏi nền nuôi cấy sau đó rửa sạch thạch bằng nước sạch hồ rễ bằng đất đã được khử trùng, các thao tác này phải nhẹ nhàng, cẩn thận tránh làm tổn thương cho cây. Cấy cây đã hồ rễ vào bầu đất như cấy cây con từ hạt. Khi cấy chú ý cho rễ thẳng và xoè ra tự nhiên, không bị cuốn lại với nhau hoặc bị gập lên trên mặt bầu.
18
Chương 2
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU