5. Những điểm mới của đề tăi
2.3.4. Phương phâp giâm sât sự lưu hănh virus lở mồm long móng trong tự nhiín
2.3.4.1. Thiết kế mẫu đại diện
Câc xê, thị trấn được chọn ngẫu nhiín trong danh sâch 50 xê, thị trấn thuộc vùng khống chế bệnh LMLM của 3 huyện, thị xê Bố Trạch, Quảng Trạch, Ba Đồn giai đoạn 2011 - 2015 để thu thập mẫu huyết thanh trđu bò. Có 8 xê, thị trấn được chọn bao gồm: xê Nam Trạch, Hưng Trạch vă thị trấn Nông trường Việt Trung (huyện Bố Trạch); xê Quảng Hòa, Quảng Sơn (thị trấn Ba Đồn), xê Quảng Xuđn, Quảng Phú vă Quảng Đông (huyện Quảng Trạch).
Mẫu huyết thanh dùng để đânh giâ sự lưu hănh virus LMLM được thu thập theo phương phâp lấy mẫu ngẫu nhiín trín đăn trđu bò nuôi tại 8 xê, thị trấn đê chọn; mỗi xê, thị trấn lấy mẫu lặp lại trong 5 thâng (từ thâng 9/2014 - thâng 01/2015). Tổng số mẫu được lấy lă 290 mẫu; trong đó huyện Bố Trạch lấy 110 mẫu, huyện Quảng Trạch 110 mẫu, thị trấn Ba Đồn 70 mẫu. Xê, thị trấn năo có tổng đăn bò thấp nhất sẽ lấy 6 mẫu/thâng; câc xê, thị trấn còn lại sẽ lấy 8 mẫu/thâng.
Bảng 2.1. Bố trí lấy mẫu huyết thanh trín địa băn nghiín cứu
Huyện/Thị xê được chọn lấy mẫu Xê/Thị trấn Số mẫu lấy mỗi thâng lấy trong 5 thâng Tổng số mẫu
Bố Trạch
Nam Trạch 6 30
Nông trường Việt Trung 8 40
Hưng Trạch 8 40
Quảng Trạch Quảng Hòa 6 30
Quảng Sơn 8 40 Ba Đồn Quảng Xuđn 6 30 Quảng Phú 8 40 Quảng Đông 8 40 Tổng 58 290
Sau khi có kết quả xĩt nghiệm mẫu huyết thanh, chọn ngẫu nhiín một số trong tổng số những con trđu bò có kết quả dương tính với khâng thể 3ABC để lấy mẫu probang. Tổng số mẫu probang đê được lấy lă 36 mẫu.
2.3.4.2. Phương phâp ELISA phât hiện khâng thể 3ABC khâng virus lở mồm long móng
* Nguyín lý của phương phâp phât hiện khâng thể 3ABC
Khi virus nhiễm văo cơ thể gia súc móng guốc chẵn, quâ trình nhđn lín của vius sẽ diễn ra. Trong quâ trình năy, virus vừa tạo ra câc thănh phần để tâi tạo câc hạt virus mới (câc virion), vừa tạo ra câc thănh phần không tham gia tạo thănh câc hạt virion mới mă chỉ đóng vai trò câc men giúp cho quâ trình nhđn bản. Câc thănh phần kết hợp nhđn bản virus có tính khâng nguyín gọi lă protein cấu trúc (structure protein). Câc thănh phần không tham gia kết hợp thănh virion mới vă có tính khâng nguyín cao gọi lă protein không cấu trúc (non-structure protein) [42].
Câc vacxin bao gồm những protein cấu trúc của virus LMLM vă do đó sau khi tiím vacxin động vật chỉ sản xuất ra khâng thể khâng protein cấu trúc của virus. Tuy nhiín, sau khi nhiễm với virus LMLM, khâng thể khâng protein không cấu trúc sẽ được tạo ra [6].
Hiện nay, nước ta đang sử dụng vacxin LMLM nhập từ hêng Merial của Phâp theo Chương trình quốc gia khống chế bệnh LMLM. Loại vacxin năy lă vô hoạt vă đê
loại bỏ những khâng nguyín không cấu trúc,sau khi tiím cho gia súc chỉ kích thích cơ thể sản sinh ra khâng thể khâng lại khâng nguyín cấu trúc của virus. Trường hợp gia súc bị nhiễm virus LMLM thì sẽ sản sinh khâng thể khâng lại khâng nguyín cấu trúc (hạt virus) chứ không có khâng thể khâng lại khâng nguyín không cấu trúc 3ABC. Do đó, dùng phản ứng ELSA sẽ phât hiện được trđu bò nhiễm virus LMLM, kể cả trđu bò đê được tiím phòng [1].
Kit PrioCHECK ® FMDV NSlă một kit ELISA dùng để phât hiện khâng thể khâng protein không cấu trúc 3ABC (nonstructural 3ABC) của virus LMLM bằng phản ứng ELISA của công ty Priomics - Hă Lan sản xuất.
Đối tượng mẫu lă huyết thanh của câc loăi động vật như: trđu, bò, cừu, dí, lợn. Câc đĩa phản ứng trong kit được phủ bởi khâng thể đơn dòng (MAB) gắn với protein không cấu trúc 3ABC của virus LMLM. Câc mẫu huyết thanh xĩt nghiệm sau đó sẽ được thím văo một MAB thứ hai có gắn với một loại enzym tạo ra tín hiệu mău.
Nếu có khâng thể trong huyết thanh xĩt nghiệm thì khâng thể năy sẽ ngăn cản khâng thể có gắn enzym (MAB thứ hai) gắn văo protein không cấu trúc 3ABC của virus LMLM. Do đó, câc mẫu dương tính thì sẽ không thể hiện mău (hình 2.1).
Hình 2.1. Hình ảnh minh họa phản ứng phât hiện khâng thể LMLM 3ABC
bằng phương phâp ELISA, bộ kit PrioCHECK ® FMD NS * Phương phâp ELISA
- Ngăy 1: Ủ huyết thanh xĩt nghiệm
Bước 1: Cho 80µl ELISA buffer đến tất cả câc giếng trong đĩa phản ứng. Bước 2: Cho 20µl Negative-Component 9 văo giếng A1 vă B1.
Bước 3: Cho 20µl Weak Positive-Component 8 văo giếng C1 vă D1. Bước 4: Cho 20µl Strong Positive-Component 7 văo giếng E1 vă F1. Bước 5: Cho 20µl huyết thanh xĩt nghiệm văo câc giếng còn lại. Bước 6: Dân kín đĩa bằng tấm dân có sẵn trong bộ kit.
Bước 7: Lắc đều đĩa.
- Ngăy 2
+ Ủ với Conjugate
Bước 1: Rửa đĩa phản ứng 6 lần với 200 - 300µl/well của nước rửa. Bước 2: Cho 100µl Conjugate đê pha loêng văo tất cả câc giếng. Bước 3: Dân kín đĩa bằng tấm dân có sẵn trong bộ kit.
Bước 4: Ủ 60 ± 5 phút ở nhiệt độ 22 ± 3oC . + Ủ với chất phât mău Chromogen-Substrate TMB
Bước 1: Rửa đĩa phản ứng 6 lần với 200 - 300µll/well của nước rửa. Bước 2: Cho 100µl TMB (Component 10) văo tất cả câc giếng Bước 3: Ủ 20 phút ở nhiệt độ 22 ± 3o
C .
Bước 4: Cho 100µl dung dịch Stop (Component 11) văo tất cả câc giếng. Bước 5: Lắc đều đĩa trước khi cho văo mây đọc.
Sơ đồ phản ứng ELISA được trình băy ở hình 2.2.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A NC 3 11 19 27 35 43 51 59 67 75 83 B NC 4 12 20 28 36 44 52 60 68 76 84 C WPC 5 13 21 29 37 45 53 61 69 77 85 D WPC 6 14 22 30 38 46 54 62 70 78 86 E PC 7 15 23 31 39 47 55 63 71 79 87 F PC 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80 88 G 1 9 17 25 33 41 49 57 65 73 81 89 H 2 10 18 26 34 42 50 58 66 74 82 90
Hình 2.2. Sơ đồ phản ứng ELISA phât hiện khâng thể 3ABC
Trong đó: NC: đối chứng đm tính
WPC: đối chứng dương tính yếu PC: đối chứng dương tính mạnh Câc giếng còn lại lă mẫu nghiín cứu.
- Đọc phản ứng
Phản ứng có mău sau khoảng 20 phút thì dừng phản ứng bằng dung dịch Stop vă đo OD (optical density) ở bước sóng 450nm.
Tính giâ trị trung bình OD 450nm ở giếng A1 vă B1 (Negative Control = OD max). Giâ trị PI (percentage Inhibition) của mẫu đối chứng vă mẫu huyết thanh xĩt nghiệm được tính bởi công thức:
- Câc điều kiện để chấp nhận kết quả:
Giâ trị PI trung bình của Positive Control phải > 70%. Giâ trị PI trung bình của Weak Positive Control phải > 50%. Giâ trị trung bình OD450 Negative Control > 1.
Câc đĩa không đạt câc tiíu chuẩn níu trín thì kết quả xĩt nghiệm không được chấp nhận.
- Đânh giâ kết quả
Nếu PI < 50%: Đânh giâ mẫu không có khâng thể (negative). Nếu PI ≥ 50%: Đânh giâ mẫu có khâng thể (positive).
2.3.4.3. Phương phâp realtime RT-PCR phât hiện virus lở mồm long móng từ mẫu probang
Phương phâp năy được dùng để phât hiện trđu bò mang trùng, phât hiện sự nhiễm trùng của gia súc ở giai đoạn tiền lđm săng trước khi hình thănh những mụn nước vă khâng thể khâng virus LMLM, phât hiện sự nhiễm trùng của gia súc ở giai đoạn hậu lđm săng. Trđu bò sau khi khỏi bệnh hoặc mắc bệnh ở thể cận lđm săng đều mang trùng vă băi xuất virus ở mức độ khâc nhau, có khi từ 2 - 3 năm. Trong trường hợp năy, trđu bò vừa lă động vật cảm nhiễm vừa lă nguồn bệnh, nguy cơ tâi phât lă rất cao. Việc phât hiện trđu bò mang trùng để đưa ra câc giải phâp ngăn chặn dịch tâi phât lă rất quan trọng.
* Nguyín lý phản ứng RT-PCR
Phản ứng realtime PCR lă một kỹ thuật PCR sử dụng câc đặc điểm của quâ trình sao chĩp DNA. Trong phản ứng PCR truyền thống, sản phẩm khuếch đại được phât hiện qua phđn tích điểm kết thúc bằng câch điện di DNA trín gel agarose khi phản ứng kết thúc. Ngược lại, RT-PCR cho phĩp phât hiện vă định lượng sự tích lũy
Giâ trị OD450 mẫu xĩt nghiệm
PI = 100 - (--- * 100)
DNA khuếch đại ngay khi phản ứng đang xảy ra. Khả năng năy được phât hiện nhờ bổ sung văo phản ứng những phđn tử phât huỳnh quang. Những hóa chất phât huỳnh quang bao gồm thuốc nhuộm liín kết DNA vă những trình tự gắn huỳnh quang liín kết đặc hiệu với primer gọi lă probe. Khi DNA tương hợp với primer thì quâ trình sao chĩp sẽ xảy ra vă sự gia tăng lượng tín hiệu huỳnh quang tỉ lệ với sự gia tăng lượng DNA. Khi sử dụng mây Realtime PCR, hệ thống ghi được tín hiệu huỳnh quang khi quâ trình khuyếch đại xảy ra. Ban đầu tín hiệu huỳnh quang còn ở tín hiệu nền ta không thể phât hiện sự gia tăng tín hiệu cho dù có quâ trình khuyếch đại vă sản phẩm đê tăng theo hăm mũ. Đến một thời điểm xâc định, sản phẩm khuếch đại đê tạo ra đủ tín hiệu huỳnh quang có thể phât hiện được. Chu kỳ năy được gọi lă chu kỳ ngưỡng Ct (Cycle of threshold). Đđy cũng lă giâ trị để đânh giâ kết quả phản ứng.
Virus LMLM có vật chất di truyền lă RNA nín trong phản ứng realtime PCR có thím quâ trình sao chĩp ngược từ RNA ->DNA gọi lă Reverse trancription nín phương phâp năy gọi lă real time RT- PCR.
* Nguyín lý hoạt động của probe
Có nhiều loại hóa chất phât huỳnh quang dựa trín primer vă probe, hóa chất được sử dụng trong phản ứng realtime RT-PCR lă Taqman Probe. Taqman Probe được sử dụng như một trình tự oligonucleotide đặc hiệu, gắn chất huỳnh quang gọi lă mẫu dò Taqman Probe, cùng với câc primer.
Taqman Probe gắn một chất huỳnh quang ở đầu 5’ vă một chất hấp phụ huỳnh quang ở đầu 3’. Khi còn nguyín vẹn, tín hiệu của chất phât huỳnh quang bị hấp phụ do nó nằm gần chất hấp phụ. Trong giai đoạn kết hợp bắt gặp vă kĩo dăi DNA trong phản ứng khuếch đại, Probe liín kết với trình tự đích vă hoạt động 5’- 3’ exonuclease đặc hiệu cho DNA mạch đôi của Taq sẽ cắt đứt đầu gắn chất huỳnh quang. Kết quả chất huỳnh quang bị tâch khỏi chất hấp phụ vă tín hiệu huỳnh quang phât ra tỉ lệ với lượng sản phẩm khuyếch đại trong mẫu.
* Chuẩn bị
- Chuẩn bị mẫu
Dịch hầu họng (probang) bảo quản trong dung dịch MEM (Modified Eagles medium - môi trường nuôi cấy tế băo) trong ống facol ở 4oC, vortex mẫu trong 15 giđy vă tiến hănh ly tđm 9000 vòng/phút trong 3 phút, dùng micropipet hút 2000µl cho văo 2 ống falcol 15ml (1ống để lưu, 1 ống để xĩt nghiệm), ống mẫu lưu chuyển đến tủ lưu mẫu -80 o
C. Đối với ống xĩt nghiệm,lấy dung dịch nổi trín để thực hiện chiết tâch RNA.
- Chuẩn bị dung dịch hóa chất chiết tâch RNA (thực hiện tại phòng chiết tâch). + Bộ kit chiết tâch mẫu - Qiagen® RNeasy Extraction Kit.
+ Hỗn hợp buffer RLT được bổ sung 2-mercaptoethanol theo tỉ lệ 1/100, hỗn hợp chỉ sử dụng trong vòng 1 thâng.
+ Hỗn hợp buffer RPE được thím văo 4 lần thể tích Ethanol (96 - 100%). Sau khi mở bộ kit chiết tâch phải ghi chĩp vă đânh dấu văo lọ hóa chất.
- Chuẩn bị hóa chất cho Master mix (quâ trình chuẩn bị được thực hiện tại phòng Master Mix vă trong PCR Cabinet).
Trước khi văo phòng Master Mix phải tính thể tích của từng loại nguyín liệu cho số mẫu xĩt nghiệm sẽ thực hiện theo nguyín tắc:
N phản ứng = số mẫu xĩt nghiệm + 02 mẫu đối chứng + 01 mẫu hao hụt.
Bảng 2.2. Thănh phần phản ứng realtime RT-PCR
(Invitrogen One-step RT- PCR Kit (Cat No. 11732-020)
TT Nguyín liệu Dung dịch mẹ Thể tích cho 1 phản ứng (µl)
1 Nước 4,5
2 2X Buffer 2X 12,5
3 MgCl2(Promega) Batch number 25mM 1,0
4 Primers1 F 20 pmol/µl 0,5
5 Primers2 R 20 pmol/µl 0,5
6 Probe 6 pmol/µl 0,5
7 Enzyme Mix 0,5
Tổng thể tích Master mix cho 1 phản ứng 20
8 Mẫu RNA 5
Tổng thể tích cho 1 phản ứng 25
Dùng cồn 70oC để lau micropipette, mặt bằng lăm việc trong PCR Cabinet. Kiểm tra vă bổ sung (khi cần thiết) số lượng câc loại tip micropipette.
Chuẩn bị “cool box” để chứa câc tube nguyín liệu, tube master mix, tube PCR hoặc đĩa PCR 96 giếng.
Lấy nguyín liệu từ ngăn đm (-) 20oC của tủ lạnh để văo ngăn +4oC để rê đông, vẫn giữ Enzyme mix ở ngăn đm (-) 20o
Trộn đều nguyín liệu bằng Votex vă ly tđm bằng Quick spin để kĩo nguyín liệu xuống đây tube.
Căn cứ văo “Tổng thể tích Master Mix cho N phản ứng” để chọn tube chứa Master Mix cho phù hợp.
Để câc tube nguyín liệu (dung dịch mẹ) trở lại ngăn đm (-) 20oC của tủ lạnh, đúng vị trí quy định,
Trộn đều Master mix bằng vortex vă ly tđm bằng Quick spin để kĩo toăn bộ Master Mix xuống đây tube trước khi chia văo câc tube PCR - dạng trip (20µl/tube) hoặc đĩa PCR 96 giếng (20µl/giếng).
Tube PCR-dạng trip/đĩa PCR 96 giếng đê chứa Master mix phải giữ lạnh bằng “cool box” vă chuyển sang Phòng Chiết tâch RNA/DNA, để văo ngăn +4oC của tủ lạnh, sẳn săng để xĩt nghiệm.
* Câc bước thực hiện
- Chiết tâch RNA bằng bộ kitQiagen® RNeasy Extraction Kit, sử dụng mây ly tđm theo câc bước như sau:
+ Vortex mẫu trong 15 giđy vă ly tđm 9000 vòng/3 phút.
+ Chuyển 500µl dung dịch RLT đê bổ sung β-mercaptoethanol văo típ mới 1,5ml. + Chuyển 300µl mẫu dịch nổi phía trín văo tube 1,5ml đê có dung dịch RLT. + Vortex trong 15 giđy vă ủ ở nhiệt độ phòng 10 phút sau đó ly tđm nhẹ.
+ Bổ sung 500µl ethanol 70% vă vortex trong 15 giđy sau đó ly tđm 9000 vòng trong 3 phút ở nhiệt độ phòng.
+ Chuyển 700µl dung dịch nổi sang cột lọc vă ly tđm 8000 vòng/1 phút. + Lặp lại bước 6 nếu dung dịch mẫu còn.
Rửa lần 1:
+ Chuyển cột lọc sang một típ ly tđm mới.
+ Bổ sung 700µldung dịch rửa RW1 văo cột lọc ly tđm ở 8000 vòng/1 phút. Rửa lần 2:
+ Chuyển cột lọc sang một típ ly tđm mới
+ Bổ sung 500µl dung dịch rửa RPE văo cột lọc. Ly tđm 8000 vòng/1 phút . + Loại bỏ dung dịch trong cột ly tđm
+ Lặp lại với 500µl dung dịch rửa RPE văo cột lọc. Ly tđm ở 8000 vòng trong 1 phút
Lăm khô cột lọc:
+ Chuyển cột lọc sang một típ ly tđm mới
+ Lăm khô bằng câch ly tđm 14.000 vòng trong 2 phút ở nhiệt độ phòng. Thu RNA:
+ Chuyển cột lọc sang một típ 1,5ml mới không có men RNase.
Cho 50l nước (RNase-free H2O) văo cột lọc, ly tđm ở 10.000 vòng 1 phút. + Chuyển mẫu RNA đê thu sang ống 0,5ml mới.
Thu giữ RNA:
Có thể giữ RNA ở 40C trong văi giờ nếu sử dụng ngay. Cất giữ ở nhiệt độ -200C nếu chưa dùng ngay trong ngăy.
- Tiến hănh Master mix cho phản ứng rRT-PCR.
Chuẩn bị Master mix theo quy trình tổng hợp nguyín liệu của Kit RT-PCR: Invitrogen One-step RT-PCR Kit (Cat No.11732-020). Quâ trình được thực hiện trong phòng Master mix.
- Tiến hănh Template mẫu
Sau khi chuẩn bị hỗn hợp Master mix chuyển sang phòng Template, tiến hănh chia đều 20µl cho mỗi ống tube 0,2ml cho phản ứng PCR. Thực hiện theo tuần tự:
+ Chuyển 5µl nước free RNA/DNA cho văo ống đối chứng đm. + Thứ tự chuyển 5µl RNA mẫu văo câc ống mẫu tiếp theo. + Chuyển 5µl đối chứng dương văo ống đối chứng dương.
Cho toăn bộ câc ống phản ứng văo spin down cho khỏi dính văo thănh ống vă chuyển sang phòng chạy mây PCR.
Khi thực hiện phải tuđn thủ theo trình tự trín, sau mỗi lần cho mẫu văo thì tiến hănh đậy nắp ống phản ứng lại trânh tạp nhiễm.
Phải sử dụng đúng loại pipet để cho mẫu văo phản ứng theo quy định. - Thực hiện phản ứng nhđn gen, vận hănh mây.
Sau khi cho mẫu RNA văo type PCR đê có nguyín liệu cho nhđn gen thì tiến