5. Những điểm mới của đề tăi
2.3.5. Phương phâp định type virus LMLM
2.3.5.1. Phđn lập, định type virus LMLM từ mẫu probang dương tính
Những mẫu probang dương tính với virus LMLM bằng phương phâp realtime PCR được gửi đến Cơ quan thú y Vùng VI để nuôi cấy phđn lập trín môi trường tế băo vă định type virus bằng phương phâp ELISA.
* Phương phâp nuôi cấy phđn lập virus LMLM trín môi trường tế băo
- Chuẩn bị
+ Chuẩn bị 10% huyễn dịch chiết mô trong dung dịch PBS 0,04M (dung dịch năy cũng có thể được sử dụng trong phương phâp ELISA).
+ Chuẩn bị lọ (25cm2) tế băo nuôi cấy BHK hay câc dòng tế băo khâc, môi trường MEM vă dung dịch PBS ABC.
+ Chuẩn bị lọ nhỏ 5ml (để pha loêng mẫu), 20ml (chứa môi trường pha mẫu) vă nhên dân ghi ký hiệu mẫu.
- Tiím truyền: thực hiện trong Cabinet class II.
+ Pha loêng mẫu huyễn dịch 10% trong môi trường đê được lọc với môi trường MEM huyết thanh: 100µl mẫu + 900µl môi trường MEM.
+ Rửa lọ tế băo: loại bỏ môi trường phât triển tế băo trong lọ ra, cho văo 5 - 8ml PBS ABC rửa qua 1 lần.
+ Cho 1ml mẫu đê được pha loêng văo lọ tế băo. Sau khi nhiễm xong, sât trùng bín ngoăi lọ kỹ, rồi chuyển đến tủ ấm ủ ở nhiệt độ 370C/45 - 60 phút. Lọ được đặt trín mây đảo (trânh trường hợp khô thảm tế băo).
+ Sau khi ủ xong, chuyển trở lại Cabinet Class II. Loại bỏ dung dịch trong lọ vă rửa lại 1 lần với PBS ABC.
+ Cho 6ml môi trường duy trì môi trường MEM văo, ủ 370C trong 48 đến 72 giờ. + Kiểm tra lọ hằng ngăy dưới kính hiển vi soi ngược, để tìm hiện tượng bệnh lý tế băo (CPE) hoặc độc tính tế băo.
Mẫu có độc tính văo ngăy thứ nhất: cấy lặp lại bằng câch sử dụng mẫu gốc. Mẫu phải được lọc bằng câch sử dụng bộ lọc 0,20μm vă được nhiễm văo tế băo đơn lớp (monolayer) BHK.
Bất kỳ mẫu quan sât có độc tính văo ngăy thứ 2 sẽ được đông lạnh ở -800C. Mẫu được lọc trước khi cấy chuyển lần thứ hai bằng câch sử dụng bộ lọc 0,20μm, rửa sạch lọ tế băo trước khi thím môi trường duy trì.
Sau ba ngăy (72 giờ) nếu không xuất hiện bệnh lý tế băo (CPE), đem đông lạnh ống nghiệm (ở - 800C), vă rê đông ba lần, sau đó gộp câc mẫu tương tự lại. Tiến hănh cấy chuyển lần thứ hai.
Nếu có bất kỳ mẫu dương tính nghi ngờ năo, câc mẫu năy được xĩt nghiệm lại vă dùng mẫu gốc tiến hănh phương phâp ELISA.
- Kết quả
+ Đọc kết quả: Lọ nhiễm phải được kiểm tra hăng ngăy dưới kính hiển vi soi ngược vă được kiểm tra bệnh lý tế băo (CPE) hoặc độc tính tế băo.
+ Giải thích:
Nếu phât hiện CPE trong mẫu cấy chuyển, nín tiến hănh xĩt nghiệm lại bằng câch phđn lập vă cả phương phâp ELISA; vă tiến hănh kiểm tra một mẫu khâc.
Nếu mẫu có kết quả độc tính, nín xĩt nghiệm lại vă/ hoặc lọc lại mẫu. Câc lọ được tiím truyền nín được xử lý qua thuốc khử trùng rồi sau đó hấp autoclave để loại bỏ chất tiím truyền sau khi hấp phụ mẫu.
* Định type virus LMLM
Phương phâp ELISA định type virus phđn lập được trín môi trường tế băo được mô tả chi tiết ở 2.3.5.2.
2.3.5.2. Phương phâp ELISA định type virus lở mồm long móng từ mẫu biểu mô
Kit FMDV ELISA được dùng để phât hiện câc khâng nguyín của virus LMLM với câc serotypes O, A, C, vă Asia1.
Câc nguyín liệu được cung cấp bởi phòng thí nghiệm tham chiếu Pirbright (Anh), với câc nguyín liệu đủ để xĩt nghiệm tối thiểu lă 360 mẫu.
Câc nguyín liệu bẫy khâng thể cung cấp trong bộ kit sẽ được phủ dưới đây đĩa lă câc rabbit antisera bao gồm câc serotype FMDV O, A, C vă Asia1.
Câc nguyín liệu phât hiện khâng thể (guinea pig antisera) bao gồm câc serotype FMDV O, A, C, vă Asia1.
Vă một khâng thể khâng guinea pig - Conjugate horse immunoglobulin peroxidase (HRP).
Câc khâng nguyín (antigen) của FMDV được sản xuất trín dòng tế băo vă bất hoạt bằng binary ethyleneimine (BEI).
Kit năy dựa trín một kỹ thuật ELISA giân tiếp sandwich (indirect sandwich ELISA technique) để xâc định sự hiện diện của FMDV trong câc mẫu như mô tả của Le Blanc Roeder vă Smith (1987; Ferris vă Dawson, 1988).
Khâng thể bắt bẫy rabbit antisera của từng serotypes khâc nhau của FMDV được gắn dưới đây đĩa. Với việc bổ sung câc mẫu xĩt nghiệm, khâng nguyín (nếu có) sẽ bị bắt dính với khâng thể đê phủ trước đó. Vă một guinea pig khâng FMDV sau đó được thím văo sẽ phản ứng (bắt dính) với khâng nguyín bị bắt dính trước đó. Câc khâng thể khâng guinea pig (conjugate) được tiếp tục thím văo. Bằng việc bổ sung chất phât mău, một sản phẩm có mău sắc được tạo ra mă có thể đo được bằng mây đọc vă cho phĩp giải thích được kết quả của câc mẫu xĩt nghiệm.
Hình 2.3. Hình ảnh minh họa phản ứng trong ELISA
* Câc bước thực hiện
- Chuẩn bị phủ đĩa
Lấy trapping rabbit antiserum từ ngăn mât tủ lạnh, sau đó lắc đều - nhẹ nhăng để bảo đảm tính đồng nhất của nguyín liệu trước khi sử dụng.
Chuẩn bị pha loêng 1:1000 cho mỗi rabbit antiserum serotype O, A, C vă Asia1 trong coating buffer pH 9,6 trín mâng chứa 8 ngăn (reservoir 8 ngăn).
A O C Asia1 A O C Asia1
Hình 2.4.Sơ đồ pha loêng rabbit antiserum serotype O, A, C vă Asia1
E E substratesubstrate conjugate conjugate test sample test sample
rabbit trapping antibody rabbit trapping antibody guinea pig detecting antibody guinea pig detecting antibody
Cho 50µl của rabbit antiserum tương ứng của câc serotype O, A, C vă Asia1 đê pha loêng văo đĩa phản ứng (Maxisorp-NUNC).
Dân kín đĩa vă ủ lắc liín tục ở nhiệt độ 35 đến 390C trong 1 giờ. Ngoăi ra đĩa có thể ủ ở nhiệt độ +1 đến +8oC qua đím (18 giờ) trong hộp nhựa ẩm ướt.
- Cho mẫu xĩt nghiệm vă đối chứng Antigen (Control Antigen). Chuẩn bị mẫu (huyễn dịch 10%) văo câc giếng phản ứng. Rửa đĩa phản ứng 5 lần với nước rửa PBS, pH 7,4 ± 0,2. Một đĩa, cho 50µl của Buffer A văo cột 1 đến cột 5.
Từ giếng 1 của hăng A vă hăng E của đĩa, sử dụng pipette đơn cho văo 12,5µl antigen serotype O.
Từ giếng 1 của hăng B vă hăng F của đĩa, sử dụng pipette đơn cho văo 12,5µl antigen serotype A.
Từ giếng 1 của hăng C vă hăng G của đĩa, sử dụng pipette đơn cho văo 12,5µl antigen serotype C.
Từ giếng 1 của hăng D vă hăng H của đĩa, sử dụng pipette đơn cho văo 12,5µl antigen Asia1.
Sử dụng pipette đa kính trộn đều từ giếng 1 của hăng A đến hăng H, sau đó chuyển 12,5µl từ giếng 1 đến giếng 2 ( từ hăng A đến H), trộn đều vă chuyễn 12,5µl từ giếng 2 đến giếng 3, trộn đều vă chuyễn 12,5µl từ giếng 3 đến giếng 4, vă loại bỏ 12,5µl từ cột 4. Đđy lă pha loêng bậc 5 cho mỗi đối chứng antigen.
Cho 50µl huyễn dịch mẫu văo cột 7 vă 8 của hăng A đến D. Tiếp tục cho câc mẫu còn lại.
Cho 50µl huyễn dịch mẫu văo cột 7 vă 8 của hăng E đến H. Tiếp tục cho câc mẫu còn lại.
Pha loêng Antigen Control 1/5 1/25 1/12
5
1/62
5 Blank Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Serotype 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Type O A Type A B Type C C Asia1 D Type O E Type A F Type C G Asia1 H
Blank Mẫu 4 Mẫu 5 Mẫu 6
Dân kín đĩa vă ủ lắc liín tục ở +35 đến +390C trong 1 giờ.
Đem dung dịch chất phât mău chromogen OPD đang giữ đm -30 đến -50C để ở nhiệt phòng trânh ânh sâng (trong tối).
- Chuẩn bị Buffer B: 0,01M PBST (BufferA) cộng 5% sữa Skim milk.
Ví dụ: chuẩn bị 100ml Buffer A thím văo 5 gam sữa Skim milk. Điều chỉnh pH ở dêy pH 7,4 ± 0,20 với 0,1M NaOH.
- Chuẩn bị Detecting Antibody Guinea Pig
Trước khi kết thúc giai đoạn ủ antigen vă mẫu xĩt nghiệm, chuẩn bị pha loêng guinea pig trong Buffer B, thực hiện trong recervoir 8 ngăn. Phải lắc đều trước khi sử dụng để đảm bảo tính đồng nhất của nguyín liệu.
Pha loêng guinea pig 1/100 trong Buffer B cho mỗi serotype O, A, C vă Asia1. Sau 1 giờ ủ, lấy đĩa phản ứng từ tủ ấm ra ngoăi vă rửa 5 lần với nước rửa PBS, pH 7,4 ± 0,2.
Cho 50µl guinea pig đê pha loêng văo hăng A đến hăng H tương ứng với câc serotype.
Dân kín đĩa vă ủ lắc liín tục ở nhiệt độ +35 đến +390C trong 1 giờ. - Chuẩn bị Conjugate
Trước khi kết thúc giai đoạn ủ Guinea pig, chuẩn bị pha loêng Conjugate 1/200 trong Buffer B.
Sau 1 giờ ủ, lấy đĩa phản ứng từ tủ ấm ra ngoăi vă rửa 5 lần với nước rửa PBS, pH 7,4 ± 0,2.
Cho 50µl conjugate đê pha loêng văo tất cả câc giếng (không phđn biệt câc serotype năo).
Dân kín đĩa vă ủ lắc liín tục ở nhiệt độ 35 đến 390
C trong 45 phút.
- Chuẩn bị dung dịch chất phât mău Substrate/Chromogen vă dung dịch dừng phản ứng Stop
Trước khi kết thúc giai đoạn ủ Conjugate, chuẩn bi dung dịch chất phât mău OPD. Chuẩn bị một đĩa sạch “blanking plate” lă đĩa không có phủ antibody trapping. Đĩa năy sau khi dùng xong có thể rửa sạch vă dân kín những giếng chưa sử dụng cho những lần xĩt nghiệm kế tiếp.
Sau 1 giờ ủ, lấy đĩa phản ứng từ tủ ấm ra ngoăi vă rửa 5 lần với dung dịch rửa PBS, pH 7,4 ± 0,2.
Một đĩa phản ứng cần chuẩn bị như sau: cho 30µl của Substrate - H2O2 3% phatrong 6ml dung dịch chất phât mău OPD. Như vậy H2O2 3% sử dụng lă 1/200.
Sau khi rửa, đầu tiín cho 50µl của substrate/chromogen văo cột bank của đĩa “blanking plate” vă sau đó lă tất cả câc giếng của đĩa phản ứng, đậy nắp để ở nhiệt độ phòng trong tối - không lắc.
Sau 15 phút ủ substrate/chromogen, đầu tiín cho 50µl của dung dịch Stop (1,25M sulphuric acid) văo cột blank của đĩa “blanking plate”, sau đó lă tất cả câc giếng của đĩa phản ứng. Lắc đều bằng mây lắc (hoặc dùng tay vỗ nhẹ văo câc thănh giếng) để bảo đảm rằng hổn hợp năy đê được trộn đều. Tất cả câc giếng lúc năy chứa 50µl substrate/chromogen vă 50µl dung dịch Stop
- Đọc đĩa phản ứng
Mật độ quang (OD: optical density) của từng giếng trong đĩa được đo bằng quang kí́.
Đĩa “banking plate” được đưa văo mây đọc trước, kế tiếp lă câc đĩa phản ứng. Trước khi đọc đĩa, cần phải đảm bảo rằng không có bong bóng trong bất kỳ giếng năo, vì điều năy sẽ gđy ra sai số quang học vă đảm bảo rằng không có dấu (ví dụ: dấu vđn tay) hoặc ngưng tụ trín thănh của đĩa phản ứng.
Nếu cần thiết, lăm vỡ bong bóng bất kỳ với một tip sạch. Lau sạch phía dưới đây đĩa bằng vải mềm.
Kiểm tra xem kính lọc 492nm của mây đọc đê được căi đặt, câc đĩa phản ứng sẵn săng đưa văo mây đọc.
- Phđn tích vă đânh giâ kết quả + Phđn tích kết quả:
Trước tiín kiểm tra sự hiển thị mău của câc giâ trị đối chứng (Control antigen) ở câc nồng độ pha loêng bậc 5 của cột 1 đến cột 4 từ hăng A đến hăng H.
Tính giâ trị trung bình của cột 5 vă 6 (cột Blank) cho mỗi serotype.
Ví dụ: Trín hăng A của serotype O, thì lấy giâ trị OD của từng nồng độ pha loêng bậc 5 trừ cho giâ trị trung bình của cột Blank (cột 5 vă 6). Tương tự tính toân cho câc serotype còn lại.
+ Đânh giâ kết quả
Nếu mẫu xĩt nghiệm có giâ trị OD trung bình sau khi đê trừ trung bình OD Blank mă > 0.1 thì mẫu năy được ghi nhận lă dương tính với serotype tương ứng đó.
Nếu mẫu xĩt nghiệm có giâ trị OD trung bình sau khi đê trừ trung bình OD Blank dừng ở 0,1 (= 0,1) thì có thể lăm lại (retesting) hoặc tiến hănh phđn lập mẫu trín tế băo (tissus culture) vă kiểm tra lại bằng ELISA.
- Tóm tắt
+ Gắn khâng thể rabbit anisera (đĩa phản ứng) trong carbonate/bicarbonate pH 9,6.
+ Ủ lắc liín tục ở +35 đến +390C. Hoặc ủ qua đím ở nhiệt độ 1 - 80C. + Chuẩn bị pha loêng mẫu vă đối chứng trong đĩa chuyển.
+ Rửa đĩa phản ứng 5 lần với nước rửa.
+ Chuyển antigen vă mẫu xĩt nghiệm đến đĩa phản ứng. + Ủ lắc liín tục 37oC trong 1 giờ.
+ Rửa đĩa phản ứng 5 lần với nước rửa.
+ Cho 50µl Guinea pig pha trong Buffer B đến tất cả câc giếng. + Ủ lắc liín tục 37oC trong 1 giờ.
+ Rửa đĩa phản ứng 5 lần với nước rửa.
+ Cho 50µl Conjugate pha trong Buffer B đến tất cả câc giếng. + Ủ lắc liín tục 37oC trong 45 phút.
+ Rửa đĩa phản ứng 5 lần với nước rửa.
+ Cho 50µl chất phât mău OPD văo tất cả câc giếng. + Ủ ở nhiệt độ phòng trong tối.
+ Cho 50µl dung dịch dừng phản ứng (dung dịch Stop). + Đọc đĩa ở bước sóng 492nm.