giai đoạn vườn ươm
2.4.1.1. Điều tra đánh giá tỷ lệ và mức độ bị hại đối với cây Keo lai và cây Mỡ trong vườn ươm
Tại vườn ươm Ban quản lý rừng phòng hộ huyện Thạch An, tỉnh Cao Bằng và vườn ươm cơ sở sản xuất kinh doanh giống cây trồng Thống Nhất. Mỗi vườn điều tra 3 luống ngẫu nhiên, mỗi luống lập 3 OTC diện tích 4m2 (2x2m)/OTC, tiến hành điều tra tất cả các cây trong OTC trong 3 tháng liên tục, thời gian từ tháng 6 đến tháng 9 cách 15 ngày điều tra 1 lần, điều tra phân cấp bệnh hại lá, thân, cành ngọn và rễ chia làm 5 cấp, theo tiêu chuẩn quốc gia về sâu hại (TCVN 8928:2013), tiêu chuẩn quốc gia về bệnh hại (TCVN
8928:2013) và Phạm Quang Thu, 2016. Phân cấp mức độ bệnh hại lá, thân, ngọn và rễ cho từng cây trên ô tiêu chuẩn cụ thể:
+ Đối với bệnh hại lá chia thành 05 cấp Cấp hại (i) Chỉ tiêu phân cấp
0 Tán lá không bị bệnh hại. 1 Tán lá bị bệnh hại dưới 25%. 2 Tán lá bị bệnh hại từ 25 đến dưới 50%. 3 Tán lá bị bệnh hại từ 50 đến 75%. 4 Tán lá bị bệnh hại trên 75%. + Đối với bệnh hại thân, cành ngọn chia làm 05 cấp Cấp hại (i) Chỉ tiêu phân cấp
0 Thân, ngọn không bị bệnh hại. 1 Thân, ngọn bị bệnh hại dưới 15%.
2 Thân, ngọn bị bệnh hại từ 15 đến dưới 30%. 3 Thân, ngọn bị bệnh hại từ 30 đến dưới 50%. 4 Thân, ngọn bị bệnh hại trên 50%.
+ Đối với bệnh hại rễ chia làm 05 cấp
Cấp hại (i) Chỉ tiêu phân cấp
0 Cây khỏe, không bị hại
1 Cây bị hại nhưng sinh trưởng bình thường 2 Một số lá khô héo
3 Cây bị khô dần 4 Cây bị chết khô
Trên cơ sở kết quả phân cấp bị hại, tính toán các chỉ tiêu sau: Tỷ lệ cây bị bệnh hại lá, thân được xác định theo công thức:
100 %= ×
N n P
Trong đó: P%: Tỷ lệ cây bị bệnh hại. N: là số cây bị bệnh hại.
N: là tổng số cây điều tra.
Chỉ số cây bị bệnh hại lá, thân bình quân trong ô tiêu chuẩn được tính
theo công thức N .vi i 1 = ni R
Trong đó: R : chỉ số bị bệnh hại bình quân.
Ni: là số cây bị hại với chỉ số bị bệnh hại i. Vi: là trị số của cấp bị bệnh hại thứ i. N: là tổng số cây điều tra.
Mức độ bị hại dựa trên chỉ số trung bình bệnh hại
o Chỉ số bị bệnh hại bình quân: 0 cây không bị bệnh.
o Chỉ số bị bệnh hại bình quân: <1,0 cây bị bệnh hại nhẹ (+)
o Chỉ số bị bênh hại bình quân: từ 1,0 -<2,0 cây bị bệnh hại trung bình (++)
o Chỉ số bị bệnh hại bình quân: từ 2,0 -< 3,0 cây bị bệnh hại nặng (+++)
o Chỉ số bị bệnh hại bình quân: từ 3,0 đến 4,0 cây bị bệnh hại rất nặng (++++)
- Thu thập mẫu bệnh.
Phương pháp tiến hành là điều tra sơ bộ toàn bộ khu vực bị bệnh, chọn các mẫu lá, thân, rễ bị bệnh có triệu chứng điển hình cắt và được gói trong giấy báo. Mẫu bệnh được đựng trong các túi giấy ghi số mẫu và mô tả một số các đặc điểm của khu vực thu mẫu.Trong quá trình thu thập mẫu lá, thân bị bệnh, bảo quản không bị dập nát.
- Phương pháp mô tả triệu chứng bệnh.
Cần phải xác định bộ phận bị bệnh: lá, thân hay rễ. Mô tả đặc điểm về màu sắc, kích thước của vết bệnh. Sử dụng kính lúp cầm tay có độ phóng đại 10 lần quan sát bề mặt vết bệnh, mô tả màu sắc, hình dạng mẫu lá, thân bị bệnh sau đó chụp ảnh và ghi số hiệu đối với các mẫu bệnh.
2.4.1.2. Phân lập nấm gây bệnh, xây dựng danh mục thành phần loài bệnh hại, xác định bệnh hại chính
- Phân lập nấm gây bệnh
+ Phân lập nấm gây bệnh từ thân, lá
Phân lập trực tiếp trên môi trường PDA: Lấy mẫu bệnh của thân/cành, tiến hành rửa sạch bằng nước cất vô trùng, cắt thành từng mẩu nhỏ 1 – 2 mm, khử trùng bề mặt bằng cồn 70% rồi rửa lại 2 – 3 lần bằng nước cất vô trùng, rồi dùng panh vô trùng lấy từng mẫu nhỏ cấy trên môi trường PDA được đựng trong hộp lồng. Đặt các hộp lồng đã cấy mẫu bệnh này trong tủ định ôn ở nhiệt độ 250C trong khoảng 2 – 3 ngày để cho sợi nấm phát triển mọc trên môi trường. Khi nấm đã mọc ta tiến hành cấy chuyển nấm sang các hộp lồng khác, tiếp tục làm như vậy cho đến khi được sợi nấm thuần khiết.
Nuôi cấy bằng bào tử và sợi nấm: Lấy mẫu bị bệnh cắt thành các đoạn nhỏ khoảng 5 – 7 cm cho vào hộp lồng đã được khử trùng, có độ ẩm thích hợp để tạo môi trường thuận lợi cho sự phát triển của nấm bệnh. Khi hình thành bào tử hoặc sợi nấm tiến hành tách trên môi trường PDA cho đến khi được sợi nấm thuần khiết.
+ Phân lập nấm gây bệnh từ rễ
Phân lập nấm gây bệnh bằng cách chọn phần rễ mới bị bệnh rửa trong nước máy và khử trùng bề mặt bằng cồn ethyl 70% trong 1 phút, để khô trên giấy thấm đã khử trùng. Dùng dụng cụ vô trùng cắt thành những miếng nhỏ dài khoảng 1-2mm. Cấy các miếng này lên môi trường phân lập (WA).
Sau 2-3 ngày tách nấm và cấy truyền lên môi trường thạch (PDA) cho đến khi thuần (Lester W et al., 1994; Lester W et al., 1999).
+ Phân lập nấm gây bệnh từ đất
Đối với phân lập nấm bệnh hại rễ ta tiến hành làm bẫy nhử như sau: Cho rễ/đất có triệu chứng bị bệnh vào trong khay, đổ nước cất ngập rễ khoảng 10 – 15cm, vớt sạch váng, bẩn nổi trên bề mặt nước. Sau 6 – 8 giờ thả lá non, tươi của các loài cây mẫn cảm với nấm gây bệnh như: lá cây họ đậu, lá dẻ, cà ổi, lá đỗ quyên..., các vật liệu bẫy sẽ nổi trên mặt nước (Hình 2.1). Sau 2-4 ngày trên lá sẽ xuất hiện nhiều đốm đen đó là triệu trứng lá bị nhiễm nấm bệnh, chọn những lá đó tiến hành phân lập. Trước tiên khử trùng bề mặt lá bệnh, cắt phần lá biểu hiện bệnh thành các miếng nhỏ, chú ý lấy phần đốm đen sát ranh giới giữa phần bị bệnh và không bệnh của lá, rồi đặt vào hộp lồng chứa môi trường CMA (corn meal agar) có kháng sinh NARPH ((Nilstat 1ml; Ampicillin 0.1g; Rifadin 0.5ml; Terraclor (PCNB) 0.1g; Hymexazol 0.05g))/lít), băng kín và theo dõi trong tủ định ôn 250C, sau 3-5 ngày các sợi nấm xuất hiện tiến hành tách và cấy truyền đến khi được sợi nấm thuần khiết.
- Xây dựng danh mục bệnh hại
Xây dựng danh mục bệnh hại dựa vào đặc điểm hình thái như dựa trên nhữmg triệu chứng bệnh đã mô tả, đặc điểm hình thái bào tử quan sát trên kính hiển vi, hình dáng, kích thước, màu sắc của bào tử và hệ sợi nấm. Giám định nấm gây bệnh hại rễ thông qua chuyên khảo về Phytophthora spp. Của Hamm B.P. and Hansen M.E. (1987) và dựa theo tài liệu “Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam” của Burgess, L.W. et al. (2009). Giám định nấm gây bệnh phấn trắng, bệnh thán thư, bệnh khô mép lá, bệnh đốm tảo.. dựa vào danh lục sinh vật gây hại trên 17 loài cây Lâm nghiệp (Phạm Quang Thu, 2016).
- Xác định bệnh hại chính
Phân cấp mức độ hại:
Căn cứ vào mức độ nguy hiểm của chúng đối với rừng trồng (dựa trên các tiêu chuẩn: mức độ hại cây, quy mô và diện tích bị hại). Việc phân hạng các loài bệnh hại thành 2 mức độ theo các tiêu chuẩn như sau:
Bệnh hại chính (hại rất nặng là cấp 4 “++++” và hại nặng là cấp 3 “+++”), ảnh hưởng đến sinh trưởng hoặc làm chết cây, đã gây thành dịch. Cần ưu tiên nghiên cứu phòng trừ hoặc lên kế hoạch phòng trừ.
Bệnh hại thường gặp (hại trung bình là cấp 2 “++” hại nhẹ là cấp 1 “+”), ít có khả năng làm chết cây và ít ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây, có khả năng gây thành dịch, với diện tích vừa và với quy mô nhỏ. Cần chú ý điều tra diễn biến tình hình gây hại của chúng, đưa vào diện ưu tiên nghiên cứu phòng trừ và Tuy nhiên cũng cần theo dõi diễn biến tình hình gây hại của chúng.
Chú ý: Bệnh hại chính đối với bệnh hại rễ chỉ cần chỉ số bị bênh hại bình quân: từ 1,0 -<2,0 vì những cây bị bệnh hại rễ thường chết nhanh, khó hồi phục thiệt hại kinh tế lơn.
- Gây bệnh nhân tạo đối với bệnh hại chính cây Keo lai và mỡ
Đánh giá tính gây bệnh của các chủng nấm phân lập được thông qua gây bệnh nhân tạo đối với cây con ngoài vườn ươm theo phương pháp lây bệnh nhân tạo vào đất trên môi trường hạt kê vỏ trấu (Lester et al., 2009).
- Đối với cây Keo lai ở giai đoạn vườn ươm
Thí nghiệm được tiến hành với 2 công thức: CT1 gây bệnh nhân tạo đối với chủng nấm Fusarium oxysporum; Công thức 2 (CT2) Đối chứng.
- Đối với cây Mỡ ở giai đoạn vườn ươm
Thí nghiệm được tiến hành với 2 công thức: CT1 gây bệnh nhân tạo đối với nấm F.oxysporum; Công thức 2 (CT2) Đối chứng mỗi công thức 30 cây 3 lần lặp.
2.4.1.4. Giám định nấm gây bệnh bằng biện pháp sinh học phân tử đối với bệnh hại chính
+ Phương pháp giám định bằng sinh học phân tử đối với một số bệnh hại chính
Tách ADN: Tách ADN của nấm sử dụng phương pháp glassmilk, cho một lượng nhỏ sợi nấm vào ống eppendorf 1.5 ml. Tán nhỏ các vật liệu trên trong ống eppendorf bằng chày kết hợp với nitơ lỏng. Thêm vào đó khoảng 200-250 µl extraction buffer (Reader và Broda, 1985). Ống eppendorf được ủ trong bể nước ở nhiệt độ 650C trong 90 phút. Sau đó được ly tâm với tốc độ 14000 vòng/phút trong 15 phút. Hút 200 µl dịch nổi được chuyển sang ống eppendorf mới trong có chứa 800 µl NaI 100% (trạng thái lạnh) và 12 µl glassmilk. Hỗn hợp được ủ lạnh trong vòng 15 phút để ADN gắn vào glassmilk (chú ý lắc thường xuyên), sau đó được ly tâm với tốc độ 14000 vòng/phút trong 10 giây. Phần kết tủa được rửa sạch bằng dung dịch wash buffer và cồn tuyệt đối. Sau đó hỗn hợp được ly tâm, tách phần kết tủa và làm khô. Phần kết tủa được hòa tan trong 25 µl dung dịch TE (10 mM Tris
HCl pH8, 1 mM EDTA), hỗn hợp được ủ trong bể nước ở 450C trong vòng 15 phút. Ống eppendorf được ly tâm ở 14000 vòng/phút từ 1- 2 phút, phần hỗn hợp chứa ADN được chuyển sang ống eppendorf mới, bảo quản ở 40C
Phản ứng PCR: Vùng ITS 1 và 2 được phản ứng từ ADN vừa thu trên bằng cặp mồi đặc hiệu cho vùng gen ITS1-F của nấm và ITS4 (Gardes và Bruns, 1993). Trong 50 µl phản ứng PCR, 10 µl ADN được sử dụng như bản mẫu. Mỗi phản ứng PCR gồm có 1x polymerase chất đệm (Fisher Biotec), 2 µM MgCl2, 0.25 µM dNTPs, 0.25 µM cho mỗi loại mồi, và 0.08 U TTH+ polymerase (Fisher Biotec) và 0.2 mg/ml chất BSA (Bovine Serum Albumin, Fisher Biotec). Thông số phản ứng PCR như sau: bước khởi đầu tách đôi sợi ADN ở 950C trong 3 phút. Sau đó là 35 chu kỳ: tách sợi ADN ở 940C trong 30 giây, giai đoạn nhân bản ở nhiệt độ 550C trong 30 giây, ở chu kỳ cuối cùng sự kéo dài được thực hiện ở 720C trong 7 phút. Phản ứng được thực hiện trên máy PCR loại PTC 225 Peltier Thermal Cycler.
Điện di: Các sản phẩm PCR được điện di trên bản gel (1% agarose) ở 100volts/cm, trong 30 phút. Thang ADN 100bp (Fisher Biotec) được sử dụng để ước lượng kích cỡ ADN. Bản gel được nhuộm trong Red safe, lắc ở tốc độ chậm trong 15 phút. ADN được quan sát dưới tia cực tím và được chụp ảnh với máy ảnh Reader UV.
Định tên vi sinh vật bằng giải trình tự
Phân đoạn rADN của vi sinh vật được khuyếch đại trên thiết bị C1000 TouchTM Thermal Cycler (Bio-Rad, Mỹ) với chương trình nhiệt được thiết lập với pha biến tính ở 94°C trong 3 phút kế tiếp là 30 chu kỳ nhiệt (94°C trong 30 giây, 52°C trong 30 giây và 72°C trong 1 phút). Quá trình khuyếch đại được hoàn tất ở 72°C trong 10 phút và sau đó sản phẩm PCR được bảo quản ở 10°C.
Sản phẩm PCR sau khi khuyếch đại được tinh chế bằng Silica beadDNA gel extraction (Thermo, Mỹ) theo khuyến cáo của hãng. Trình tự ADN được đọc bằng phương pháp “dideoxy chain termination” với việc sử dụng kit BigDye® Terminator v3.1 Sequencing Standard (Thermo, Mỹ) theo hướng dẫn của hãng. Máy đọc trình tự, model 3500Genetic analyzer của hãng Thermo được sử dụng. Các chuỗi ADN được so sánh với cơ sở dữ liệu của GenBank thông qua giao diện tìm kiếm giao diện tìm kiếm BLAST nucleotide-nucleotide đặt tại National Center for Biotechnology Information, Bethesda, Mỹ: http://www.ncbi.nlm.nih.gov hoặc http://www.ezbiocloud.net/. Các chuỗi liên quan được chuyển tải về sau đó xử lý bằng phần mềm BioEdit (Hall, 1999).
2.4.2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học bệnh hại chính ở vườn ươm đối với cây Keo lai và cây mỡ cây Keo lai và cây mỡ
- Nghiên cứu đặc điểm hình thái bào tử và hệ sợi.
Từ các chủng nấm phân lập được từ các mẫu bệnh ở vườn ươm và rừng trồng tiến hành nuôi cấy hệ sợi và bào tử. Trong 3-10 ngày có thể kiểm tra để mô tả hình thái, màu sắc, kích thước của hệ sợi và bào tử bằng kính hiển vi soi nổi Leica M165 và BX 50 với độ phóng đại 400x.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ, độ ẩm đến sinh trưởng của nấm gây bệnh
Đánh giá sinh trưởng của hệ sợi nấm gây bệnh hại chính ở các điều kiện nhiệt độ và ẩm độ như sau:
Nhiệt độ 6 công thức: 15oC, 20oC, 25oC, 30oC, 35oC, 40oC, Độ ẩm 6 công thức: 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%
Thí nghiệm độ ẩm được tiến hành theo phương pháp Booth.C.P. Dung dịch NaCl được pha với các nồng độ khác nhau và được đổ vào bình hút ẩm.
Nacl (g/lít) 16 32 48 64 80 96