Kết quả phân lập nấm từ các bộ phận của cây Keo lai tại 2 địa điểm nghiên cứu kết quả thu được 1 chủng nấm FCB1. Tiến hành gây bệnh nhân tạo kết quả được trình bày ở bảng 3.4:
Bảng 3.4: Tính gây bệnh của hai chủng nấm Fusarium oxysporum
Stt Công thức Tỷ lệ bị bệnh P (%) Mức độ bị bệnh R
1 CT1 100% 3,1
2 CT2 (ĐC) 0 0
Số liệu ở bảng 3.4 cho thấy chủng nấm phân lập được có khả năng gây bệnh đối với cây Keo lai. Thí nghiệm gây bệnh cho thấy gây hại ở mức độ rất nặng trong khi đó công thức đối chứng không bị bệnh.
Các triệu chứng biểu hiện khi gây bệnh nhân tạo giống với các triệu chứng bệnh ở ngoài tự nhiên. Lấy phần bị bệnh phân lập lại thấy kết quả giống với nấm bệnh đã phân lập ban đầu. Do vậy nấm gây bệnh đối với cây Keo lai khi giâm hom và ở giai đoạn vườn ươm là do nấm Fusarium oxysporum.
3.1.4. Giám định nấm gây bệnh bằng biện pháp sinh học phân tử - Đối với bệnh hại chính cây Keo lai - Đối với bệnh hại chính cây Keo lai
So sánh trình tự đoạn ITS của chủng FCB1 với trình tự của nấm
Fusarium oxysporum đã công bố cho thấy có độ tương đồng từ 100%. Vậy chủng nấm FCB1 là nấm Fusarium oxysporum dựa vào đặc điểm hình thái bào tử và giám định ADN nấm gây bệnh được định danh đều là loài Fusarium oxysporum
Chủng FCB1 GTTGGGGTTTAACGGCGTGGCCGCGACGATTACCAGTAACGAGGGTTTTAC TACTACGCTATGGAAGCTCGACGTGACCGCCAATCAATTTGAGGAACGCGA ATTAACGCGAGTCCCAACACCAAGCTGTGCTTGAGGGTTGAAATGACGCTC GAACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGAT TCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTTGCTGCGT TCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTTATT TATGGTTTTACTCAGAAGTTACATATAGAAACAGAGTTTAGGGGTCCTCTGG CGGGCCGTCCCGTTTTACCGGGAGCGGGCTGATCCGCCGAGGCAACAAGTG GTATGTTCACAGGGGTTTGGGAGTTGTAAACTCGGTAATGATCCCTCCGCA GGTTCACCTACGG. Fusarium oxysporum Sequence ID: HF566401 Identities 476/476(100%). - Đối với bệnh hại chính cây mỡ
+ Đặc điểm bào tử: Ở 2 khu vực thu mẫu Ban quản lý rừng phòng hộ huyện Thạch An và cơ sở sản xuất kinh doanh giống cây trồng Thống Nhất. Tổ chức bị bệnh tạo thành các đốm màu nâu, hình e líp. Để ẩm cành, lá, thân bị bệnh từ 3 - 5 ngày và soi trên kính hiển vi quang học ta thấy thể quả nấm xuất hiện khối bào tử vô tính hình tròn màu da cam.
1 mm 10 µ m
Hình 3.4: Khối bào tử vô tính Hình 3.5: Bào tử nấm
C. gloeosporioides gây bệnh
Giai đoạn vô tính (Anamorph): Bào tử phân sinh hình bầu dục, hình hạt gạo, hình trụ kéo dài đơn bào không mầu, sau khi thành thục có mầu nâu. Bào tử nảy mầm có thể bám hình chùy. Bào tử không có vách ngăn nhưng đặc biệt là ở
trước giai đoạn nẩy mầm bào tử thường có một vách ngăn ngang hình thành hai tế bào có mầu nâu, bào tử có chiều dài từ 11,87µm - 16,38µm, chiều rộng 3,26 - 4,78µm. Thể sinh bào tử dạng đĩa có mầu nâu nhạt, nằm rải rác dưới vỏ cây, sau đó màng lộ ra ngoài mầu nâu đen khi chín nứt ra và bào tử bay ra ngoài gặp điều kiện thuận lợi nẩy mầm thực hiện quá trình xâm nhiễm mới trong mùa sinh trưởng. Thể sinh bào tử có kích thước chiều dài 121,5 - 182,7µm và chiều rộng 42 - 53,6µm. Bên trong của đĩa bào tử có cuống bào tử mọc ra trên đó, cuống bào tử không mầu đơn bào, có kích thước chiều dài 101,8µm và chiều rộng 4,1 - 6,3µm.
- Phân lập, đặc điểm của hệ sợi nấm
Nấm gây bệnh được phân lập từ các bộ lá của cây mỡ bằng phương pháp nuôi cấy hệ sợi nấm và nuôi cấy bào tử trên môi trường PDA ở nhiệt độ 280C kết quả thu được 1 chủng nấm gây bệnh ký hiệu CB1.
Hình 3.6: Hệ sợi chủng nấm CB1
+ Đối với bệnh hại chính cây Mỡ do nấm Colletotrichum gloeosporioides
Trong phòng thí nghiệm
Tính gây bệnh của các chủng nấm trong phòng thí nghiệm: 1 chủng nấm (CB1) đã phân lập được từ khu vực nghiên cứu tiến hành gây bệnh nhân tạo trong phòng thí nghiệm kết quả được trình bày ở bảng 3.5.
trong phòng thí nghiệm
Stt Công thức Tỷ lệ bị bệnh P (%) Mức độ bị bệnh R
1 CT1 100% 3,0
2 CT2 (ĐC) 0 0
Ngoài vườn ươm: Thí nghiệm được tiến hành với 2 công thức mỗi công
thức 3 lần lặp. Công thức 1(CT1): Lấy chủng nấm C. gloeosporioides ở trên cho riêng vào bình dung dịch nước cất mỗi bình 500ml mật độ 1x105 cfu/ml, sau phun vào 30 cây mỡ không bị bệnh trong giai đoạn vườn ươm (90 ngày tuổi) tại vườn ươm của Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam (Phường Đức Thắng, quận Bắc Từ Liêm, Hà Nội) thí nghiệm được đặt ở nơi dâm mát phù hợp cho cả nấm và cây phát triển. Công thức 2 (CT2): Đối chứng làm tương tự CT1 nhưng thay bằng nước cất. Sau 30 ngày đánh giá tỷ lệ bị bệnh và cấp bị bệnh được trình bày ở bảng 3.6:
Bảng 3.6: Khả năng gây bệnh của các chủng nấm C. gloeosporioides đối với Cây mỡ trong giai đoạn vườn ươm
Stt Công thức Tỷ lệ bị bệnh P (%) Mức độ bị bệnh R
1 CT1 100% 3,3
2 CT2 (ĐC) 0 0
Qua số liệu ở bảng 3.6 cho thấy chủng nấm phân lập được có khả năng gây bệnh thán thư đối với cây mỡ trong giai đoạn vườn ươm. Chủng CB1 tạo cho cây mỡ trong giai đoạn vườn ươm bị bệnh ở mức độ rất nặng. Các triệu chứng biểu hiện khi gây bệnh nhân tạo trong giai đoạn vườn ươm, giống với các triệu chứng bệnh ban đầu ngoài tự nhiên. Lấy phần bị bệnh phân lập lại thấy kết quả giống với nấm bệnh đã phân lập ban đầu. Vậy nguyên nhân gây bệnh khô thán thư cây mỡ do nấm C. gloeosporioides.
+ Giám định bằng sinh học phân tử:
Để khẳng định lại kết quả giám định bằng so sánh trình tự nucleotit của đoạn ITS trong 28 rRNA của chúng. Đoạn ITS được khuếch đại với cặp mồi
NL1 và ITS4. Sản phẩm PCR được tinh chế bằng kit QIAEX II (Qiagen, Đức) rồi đọc trình tự bằng mồi ITS4.
Chủng CB1
FJ755268 Colletotrichum gloeosporioides strain CZ043C Identities = 733/736 (99.6%)
So sánh trình tự đoạn ITS của chủng CB1 với trình tự của nấm C. gloeosporioides đã công bố cho thấy có độ tương đồng từ 99,6%. Vậy chủng nấm CB1 là nấm Colletotrichum gloeosporioides dựa vào đặc điểm hình thái bào tử và giám định ADN nấm gây bệnh được định danh đều là loài C. gloeosporioides. Trình tự phân đoạn ITS của chủng CB1 thu được như sau: ACCCTTTGTGACATACCTATAACTGTTGCTTCGGCGGGTAGGGTCTCCGC GACCCTCCCGGCCTCCCGCCTCCGGGCGGGTCGGCGCCCGCCGGAGGATAA CCAAACTCTGATTTAACGACGTTTCTTCTGAGTGGTACAAGCAAATAATCAA AACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGA AATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTG AACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTC ATTTCAACCCTCAAGCTCTGCTTGGTGTTGGGGCCCTACAGCTGATGTAGGC CCTCAAAGGTAGTGGCGGACCCTCTCGGAGCCTCCTTTGCGTAGTAACTTTA CGTCTCGCACTGGGATCCGGAGGGACTCTTGCCGTAAAACCCCCAATTTTCC AAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCA ATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTG AAGCGGCAACAGCTCAAATTTGAAATCTGGCCCTAGGCCCGAGTTGTAATT TGCAGAGGATGCTTTTGGTGCGGTGCCTTCCAAGTTCCCTAGAACGGGACG CCAGAGAGGGTGAGAGCCCCGTACAGTTGGACACCAAGCCTTTGTAAAGCT CCTTCGACGAGTCGAGTA
FJ755268 Colletotrichum gloeosporioides strain CZ043C Identities = 733/736 (99.6%)