Để đạt được các kết quả gắn với các nội dung nghiên cứu trên, cách thức và giải pháp thực hiện ý tưởng bao gồm như sau:
* Phương pháp kế thừa
-Kế thừa những những tài liệu về điều kiện tự nhiên, kinh tế - xã hội ở khu vực nghiên cứu và các tài liệu nghiên cứu có liên quan đến vấn đề nghiên cứu.
-Kế thừa kinh nghiệm sử dụng cây thuốc của các ông lang, bà mế người dân tộc Nùng, Dao ở khu vực nghiên cứu.
* Phương pháp điều tra thực địa
-Điều tra phỏng vấn thu thập cây thuốc: tại khu vực nghiên cứu, phỏng vấn các ông lang, bà mế, người dân có kinh nghiệm sử dụng cây thuốc và sử dụng các bài thuốc gia truyền của cộng đồng dân tộc ít người tại địa bàn nghiên cứu. Mẫu phiếu điều tra dựa theo: phiếu điều tra cây thuốc trong cộng đồng và phiếu điều tra bài thuốc gian dân (Viện Dược liệu, Bộ Y tế) [27].
Bảng 3.1. Mẫu bảng điều tra nguồn cây thuốc được cộng đồng một số dân tộc thiểu số ở khu vực nghiên cứu sử dụng trong phòng và điều trị bệnh
22
Địa điểm điều tra: Địa chỉ điều tra:
TT Tên phổ thông Tên địa phương Số hiệu mẫu / ảnh Dạng cây Môi trường sống Bộ phận sử dụng Cách sử dụng Công dụng Cán bộ được phỏng vấn Họ tên Địa chỉ Điên thoại (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) ……. …… …. ….. ……. …… ….. ….. ….. …. …..
-Thu thập đầy đủ các thông tin cây thuốc gồm: tên phổ thông, tên dân tộc Nùng, Dao; số hiệu mẫu/ảnh cây thuốc; dạng sống; môi trường sống; bộ phận sử dụng làm thuốc (thân, rễ, hoa, quả, hạt, nhựa, vỏ); công dụng. Đồng thời ghi chép những đặc điểm dễ nhận biết của cây ngoài thiên nhiên, ghi rõ thời gian, địa điểm và người thu thập thông tin.
-Định danh tên cây: định danh loài cây theo các bước: (i) định danh tại thực địa; (ii) sử dụng kiến thức kinh nghiệm của các chuyên gia và nguồn tài liệu tin cậy đã công bố giám định lại.
+ Bước 1: xác định sơ bộ tên địa phương, tên thường gọi được thực hiện ngay ở lần điều tra đầu tiên. Đối với những loài chưa chắc chắn thì ghi chú để kiểm định lại ở bước sau. Các loài không biết tên cần phải lấy mẫu (lá, hoa, quả,...) và ghi vào biểu điều tra bằng ký hiệu sp1, sp2,... để giám định.
+ Bước 2: Tất cả các cây được thẩm định lại tên cây, lập danh mục cây thuốc bằng sử dụng kiến thức kinh nghiệm của các chuyên gia về thực vật và nguồn tài liệu tin cậy đã công bố gồm: Cây cỏ Việt Nam (Phạm Hoàng Hộ, 2001) [10], Từ điển Cây thuốc Việt Nam (Võ Văn Chi, 2012) [6], Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam (Đỗ Tất Lợi, 2005) [14], Danh lục các loài thực vật Việt Nam (Trung tâm NCTN&MT – Đại học Quốc gia Hà Nội và Viện ST&TNSV, 2001 – 2005) [26]. Danh sách tên cây thuốc sẽ được hoàn thiện ở bước này.
23
* Phương pháp thu thập mẫu: Đối với loài cây chưa xác định được tên ở ngoài thực địa và loài cần giám định lại tên.
-Tiến hành thu mẫu ở thực địa: Mỗi cây thuốc thu từ 3 đến 10 mẫu ( lá, hoa, quả, thân, rễ,...) và được gắn nhãn ghi rõ các thông tin về ký hiệu mẫu, địa điểm, thời gian và người thu mẫu (các mẫu cùng cây đánh số cùng số hiệu mẫu).
-Dụng cụ thu mẫu: bản gỗ ép mẫu, túi đựng mẫu, bao tải dứa, kéo cắt cây, giấy báo, dây buộc, etyket, bút chữ A, sổ ghi chép, máy ảnh (Nguyễn Nghĩa Thìn, 1997) [17].
Hình 3.1: Các dụng cụ sử dụng cho nghiên cứu trong đề tài
* Phương pháp đánh giá tính đa dạng nguồn tài nguyên cây thuốc
Để đánh giá tính đa dạng nguồn tài nguyên cây thuốc của cộng đồng dân tộc Nùng, Dao tại khu vực nghiên cứu, tôi sử dụng phương pháp đánh giá của Nguyễn Nghĩa Thìn (2007) [18]:
- Đa dạng về bậc phân loại: ngành, lớp, họ, chi, loài.
- Đa dạng về dạng sống: dây leo, gỗ trung bình, gỗ nhỏ, thảo, bụi. - Đa dạng về môi trường sống: rừng, đồi, vườn, ven suối.
24
- Đa dạng về bộ phận sử dụng làm thuốc: thân, rễ, lá, hoa, quả, hạt, vỏ, cả cây.
- Đa dạng về các nhóm bệnh chữa trị: bệnh về khớp, tim, dạ dày, gan, giải độc, xương,…
*Phương pháp đánh giá mức độ nguy cấp
Đánh giá mức độ nguy cấp của các loài cây thuốc, xác định những cây thuốc thuộc diện bảo tồn ở khu vực nghiên cứu theo: Sách đỏ Việt Nam, phần thực vật rừng (Bộ KH&CN, 2007) [23], Nghị định 06/2019/NĐ-CP (Chính phủ nước Việt Nam, 2019) [24], Danh sách đỏ cây thuốc Việt Nam trong Cẩm nang cây thuốc cần được bảo vệ ở Việt Nam (Nguyễn Tập, 2007) [15]. Các mức đánh giá về độ nguy cấp được liệt kê trong Sách Đỏ Việt Nam bao gồm:
Cực kỳ nguy cấp (CE): Critically Endangered Nhóm nguy cấp (EN): Endangered
Sẽ nguy cấp (VU): Vulnerable
Sắp bị đe dọa (NT): Near Threatened Mức độ hiếm ( R): Rare
Bị đe dọa (T): Threatened
Nhóm thiếu dữ liệu thống kê (K): Insufficiently known
Ngoài ra, theo Nghị định 06/2019 của Chính phủ thì các loài động, thực vật rừng sẽ được chia thành các nhóm chính sau:
Nhóm I: Các loài động thực vật rừng đang có nguy cơ tuyệt chủng, nghiêm cấm mọi hành vi khai thác và sử dụng với mục đích thương mại. Nhóm IA là các loài thực vật còn nhóm IB là động vật rừng.
Nhóm II: Bao gồm những loài động thực vật rừng chưa bị đe dọa tuyệt chủng nhưng cần được bảo vệ và hạn chế khai thác, sử dụng với mục đích thương mại. Nhóm IIA là các loài thực vật còn IIB là các động vật rừng.
*Phương pháp nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn
25
Nguyên liệu lá, thân, rễ cây thuốc sau khi thu hái được rửa sạch, để ráo nước sau đó đem sấy khô ở 900C đến khối lượng không đổi.
-Nguyên liệu sau khi sấy khô được nghiền trong máy xay đa năng loại nhỏ thành bột dạng mịn, bảo quản nơi khô ráo để sử dụng trong các nghiên cứu tiếp theo.
-Bước 2: Tạo cao chiết
Nguyên liệu được tách chiết theo phương pháp ngâm nóng. Nguyên liệu dạng bột khô được đem đi chiết với tỷ lệ 10 g/100 ml bằng dung môi methanol, sau đó cho vào máy lắc với tần số 200 vòng/phút (để các chất có hoạt tính sinh học tan đều trong dung môi) ở các điều kiện thời gian 24 giờ, sau đó tiến hành lọc qua giấy lọc, 80 ml dịch lọc được đem đi cô đặc bằng máy cô quay (hoặc sấy khô) đến khi có khối lượng khô không đổi và được bảo quản ở 40C để sử dụng trong các nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn.
-Bước 3: Chuẩn bị giống vi khuẩn
Sử dụng 2 chủng vi khuẩn gồm 1 chủng gram dương là S.a
(Staphylococcus aureus) và 1 chủng gram âm là E.coli (Escherichia coli), lấy từ phòng thí nghiệm Vi sinh - Trường Đại học Khoa học Thái Nguyên. Bảo quản giống trên môi trường thạch nghiêng: vi sinh vật được hoạt hóa trong môi trường LB, sau đó được cấy chuyển sang môi trường thạch nghiêng, nuôi 24 giờ ở 370C, giữ trong tủ lạnh để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.
-Bước 4: Thử khả năng kháng khuẩn
Kiểm tra khả năng kháng khuẩn của cao chiết bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch, thí nhiệm được bố trí 3 lần nhắc lại trên một chủng vi khuẩn 3 đĩa petri trên 1 lần nhắc lại.
Pha cao chiết của toàn thân cây thuốc với nước ở nồng độ 100 mg/ml sau đó dùng cao đã pha để thử hoạt tính kháng khuẩn.
26
Các thao tác được thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Khi mật độ vi khuẩn đạt đến nồng độ 106 tế bào/ml, lắc đều ống nghiệm chứa vi khuẩn. Môi trường LB đã được hóa lỏng trong lò vi sóng, khi còn lỏng đổ đều môi trường vào các đĩa Petri, sau đó để nguội để môi trường đông đặc lại tạo thành mặt phẳng. Dùng micropipet hút 100μl dịch vi khuẩn vào giữa đĩa thạch chứa môi trường LB (Thành phần của môi trường LB là như sau (g/l): Peptone - 10; Cao nấm men - 5; NaCl -10; pH: 7,0), dùng que cấy tam giác trang đều cho đến khi mặt thạch khô. Sau 15 phút đục giếng trên môi trường thạch với đường kính 6 mm, đục 2 giếng, mỗi giếng cách nhau 2 – 3 cm. Mỗi giếng thạch nhỏ 100μl dịch cao chiết cần nghiên cứu bằng micropipet, sử dụng đối chứng dương là kháng sinh Kanamycin và Akamicin với nồng độ 5mg/ml để so sánh, để các đĩa thạch trong tủ lạnh 30 phút để dịch cao chiết khuếch tán ra môi trường nuôi cấy vi khuẩn, sau đó nuôi cấy trong tủ ấm 370C, sau 24h mang ra đo kích thước vòng kháng khuẩn. Hoạt tính kháng khuẩn được xác định bằng cách đo kích thước vùng kháng khuẩn (BK) bằng công thức: BK = D - d, trong đó D là đường kính vòng kháng khuẩn, d là đường kính giếng thạch.
27
PHẦN 4
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1. Đa dạng các bậc taxon nguồn tài nguyên cây thuốc được sử dụng trong cộng đồng các dân tộc thiểu số xã Phú Xuyên, huyện Đại Từ, tỉnh
Thái Nguyên