2.2.2. Kết quả xét nghiệm mẫu bệnh phẩm của lợn nghi mắc bệnh dịch tả châu Phi 2.2.3. Diễn biến của bệnh dịch tả lợn châu Phi tại các địa phương của tỉnh Quảng Ninh
2.2.4. Tình hình lợn tiêu hủy do dịch tả lợn châu Phi tại các địa phương của tỉnh Quảng Ninh Quảng Ninh
2.2.5. Tình hình mắc bệnh dịch tả lợn châu Phi theo mùa tại tỉnh Quảng Ninh 2.2.6. Tình hình mắc bệnh dịch tả lợn châu Phi tại các địa phương của tỉnh 2.2.6. Tình hình mắc bệnh dịch tả lợn châu Phi tại các địa phương của tỉnh Quảng Ninh theo phương thức chăn nuôi
2.2.7. Nghiên cứu tình hình mắc bệnh dịch tả lợn châu Phi tại các địa phương của tỉnh Quảng Ninh theo loại lợn của tỉnh Quảng Ninh theo loại lợn
2.2.8. Công tác phòng chống dịch tả lợn châu Phi tại tỉnh Quảng Ninh
- Công tác phòng chống dịch bệnh cấp trung ương
- Công tác phòng chống dịch bệnh chung của tỉnh Quảng Ninh - Thiệt hại kinh tế do dịch bệnh gây ra
2.2.9. Xây dựng bản đồ dịch tễ lợn mắc bệnh dịch tả châu Phi tại tỉnh Quảng Ninh 2.2.10. Một sốđặc điểm bệnh lý của bệnh dịch tả lợn châu Phi tại tỉnh Quảng Ninh 2.2.10. Một sốđặc điểm bệnh lý của bệnh dịch tả lợn châu Phi tại tỉnh Quảng Ninh
- Triệu chứng lâm sàng lợn mắc bệnh dịch tả châu Phi
- Bệnh tích: (đại thể và vi thể) lợn mắc bệnh dịch tả châu Phi
2.2.11. Đề xuất biện pháp phòng chống bệnh dịch tả lợn châu Phi tại tỉnh Quảng Ninh
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp áp dụng để nghiên cứu đặc điểm dịch tễ và vẽ biểu đồ
- Phương pháp điều tra dịch tễ học hồi cứu, dựa vào số liệu của Cục thống kê, Chi cục Thú y tỉnh Quảng Ninh năm 2019:
+ Báo cáo tình hình chăn nuôi trên dịa bàn tỉnh Quảng Ninh
+ Báo cáo nhanh theo ngày, theo tháng, quý, báo cáo năm về tình hình dịch tả lợn châu Phi tại Quảng Ninh
+ Điều tra nghiên cứu trực tiếp thông qua phiếu điều tra tại các huyện trong tỉnh Quảng Ninh (mẫu phiếu điều tra theo Phụ lục 1)
- Tập hợp xử lý số liệu để xây dựng bản đồ dịch tễ
2.3.2. Phương pháp xét nghiệm mẫu
Để xác định vi rút DTLCP: dùng huyết thanh và mẫu bệnh phẩm (hạch lâm ba, phủ tạng như lách, thận...) của lợn nghi mắc bệnh DTLCP
2.3.2.1. Phương pháp lấy mẫu
* Phương pháp lấy mẫu huyết thanh:
- Dùng bơm tiêm loại 10 ml đã được tráng chất chống đông EDTA 0,5% hoặc Heparin hút 3 ml máu từ tĩnh mạch cổ lợn đang ốm, sốt, sau đó hút pittong ra đến 5 ml, bẻ gập đầu kim và đậy nắp kim lại.
- Mẫu được bảo quản ở nhiệt độ 4oC
* Phương pháp lấy mẫu bệnh phẩm:
- Thu thập mẫu bệnh phẩm ở những con lợn chết theo hướng dẫn của Cục Thú y tại công văn số 687/TY-DT ngày 19/4/2019 và tuân thủ các quy tắc an toàn sinh học theo hướng dẫn của OIE để tiến hành xét nghiệm vi rút.
- Loại mẫu bệnh phẩm là các hạch lâm ba (lympho) bẹn, hạch dưới hàm hoặc phủ tạng như lách, thận.
- Mẫu được bảo quản trong túi nilon hoặc lọ đựng bệnh phẩm vô trùng, tất cả được đặt trong thùng bảo ôn và vận chuyển trong điều kiện lạnh từ 20C đến 80C. Mẫu bệnh phẩm gửi đến phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ sau khi lấy, kèm theo phiếu gửi bệnh phẩm, nếu quá thời gian đó, bệnh phẩm phải được bảo quản ở nhiệt độ đông băng. Huyết thanh bảo quản ở nhiệt độ từ 40C đến 80C tối đa trong 7 ngày. Lưu mẫu bệnh phẩm ở nhiệt độ -200C đến -800C
2.3.2.2. Phương pháp xét nghiệm
Để phát hiện bệnh DTLCP chủ yếu dùng phương pháp realtime PCR
Phương pháp realtime PCR phát hiện vi rút DTLCP (King và cs., 2003) theo khuyến cáo của OIE (2016).
Các bước thực hiện được trình bày theo TCVN 8400-41:2019 Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 41: Bệnh dịch tả lợn châu Phi. Đoạn mồi và mẫu dò được thiết kế dựa trên vùng ổn định của gen P72 (bảng 1, phụ lục 2) và được sử dụng với nồng độ thích hợp, như sau:
+ Mồi sử dụng ở nồng độ 20 µM + Đoạn dò sử dụng ở nồng độ 5 µM - Tiến hành phản ứng realtime PCR
+ Sử dụng cặp mồi đã chuẩn bị trên và bộ kít thương mại, pha hỗn hợp phản ứng (Master mix) và cài đặt chu trình nhiệt theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Có thể áp dụng kít Master mix Platinum® Quantitative PCR SuperMix – UDG, Cat. No.: 11730-017 của hãng Invitrogen (nếu áp dụng kít khác có thể thay đổi công thức master mix).
+ Lượng hỗn hợp nhân gen dùng cho 1 phản ứng được nêu trong bảng 2, phụ lục 2. + Sau khi chuẩn bị xong nguyên liệu Master mix tiến hành:
+ Cho 20 µl hỗn hợp Master mix vào ống PCR 0,2 ml.
+ Cho 5 µl DNA dương chuẩn của vi rút ASF có giá trị Ct đã biết trước vào ống PCR đối chứng dương
+ Cho 5 µl nước tinh khiết, không có nuclease vào ống PCR đối chứng âm + Cho 5 µl DNA của mẫu vừa tách chiết vào ống PCR
* Lưu ý: Phản ứng realtime PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu đối chứng dương và mẫu đối chứng âm.
+ Chu trình nhiệt chạy phản ứng theo kít Platinum® Quantitative PCR SuperMix – UDG, Cat. No.: 11730-017 nêu trong bảng 3, phụ lục 2.
* Chú thích: Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng realtime PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.
- Đọc kết quả
+ Kết quả của phản ứng real-time PCR được xác định dựa vào chu kỳ ngưỡng (Cycle threshold: Ct).
+ Phản ứng được công nhận khi: mẫu đối chứng dương tính (được chuẩn độ trước) phải có giá trị Ct tương đương giá trị Ct đã biết (± 2 Ct), mẫu đối chứng âm không có Ct.
+ Với điều kiện phản ứng:
• Mẫu dương tính khi giá trị Ct < 40
• Mẫu âm tính khi không có giá trị Ct
• Mẫu nghi ngờ khi giá trị 40 ≤ Ct ≤ 45.
- Đánh giá kết quả: Mẫu có vi rút gây bệnh dịch tả lợn châu Phi khi kết quả real-time PCR dương tính. Với những mẫu nghi ngờ cần được thực hiện lại xét nghiệm hoặc sử dụng phương pháp xét nghiệm khác để khẳng định kết quả.
* Quy định về loại lợn: Lợn nái, lợn thịt và lợn con - Mùa vụ: nghiên cứu ở 4 mùa vụ trong năm. + Mùa đông: từ tháng 11/2019 đến tháng 01/2020 + Mùa xuân: từ tháng 02/2019 đến tháng 4/2019 + Mùa hè: từ tháng 5/2019 đến tháng 7/2019 + Mùa thu: từ tháng 8/2019 đến tháng 10/2019
- Phương thức chăn nuôi: nghiên cứu ở 2 phương thức chăn nuôi lợn.
+ Phương thức truyền thống (nuôi chuồng hở, nuôi thả, tận dụng thức ăn thừa): hộ gia đình chăn nuôi với số lượng ít (chăn nuôi nhỏ lẻ).
+ Phương thức công nghiệp gồm chuồng kín và chuồng hở: chăn nuôi với số lượng lớn (chăn nuôi trang trại), điều kiện vệ sinh thú y tốt.
2.3.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm bệnh lý của bệnh
- Kiểm tra biểu hiện lâm sàng: Chúng tôi sử dụng phương pháp chẩn đoán cơ bản là quan sát những biểu hiện của lợn như: đo nhiệt độ, biểu hiện một số vùng da dưới ngực và bụng có màu khác thường, di chuyển không vững, tiêu chảy ...
- Phương pháp xét nghiệm máu để xác định một số chỉ số huyết học của lợn bị bệnh DTCP và lợn khỏe: Số lượng hồng cầu, bạch cầu, hàm lượng huyết sắc tố và công thức bạch cầu của lợn bệnh và lợn khỏe được xác định bằng máy PCE 210 và XP 100 tại Trung tâm kiểm soát bệnh tật (CDC) tỉnh Quảng Ninh.
- Phương pháp xác định bệnh tích đại thể, vi thể
+ Phương pháp xác định bệnh tích đại thể: Mổ khám lợn bị bệnh DTLCP (có biểu hiện lâm sàng của bệnh DTLCP), quan sát bằng mắt thường bệnh tích tại các cơ quan nội tạng có biểu hiện đặc trưng như: lá lách, ruột, tim, hạch..., chụp ảnh những vùng có bệnh tích điển hình.
+ Nghiên cứu biến đổi bệnh lý vi thể bằng phương pháp làm tiêu bản tổ chức học theo quy trình tẩm đúc parafin, nhuộm Hematoxilin- eosin, đọc kết quả dưới kính hiển vi quang học Labophot - 2 và chụp ảnh bằng máy ảnh gắn trên kính hiển vi.
Phương pháp làm tiêu bản vi thể các mẫu bệnh phẩm có bệnh tích đại thể theo thứ tự các bước sau:
+ Lấy bệnh phẩm: lá lách, hạch màng treo ruột, thận có biểu hiện bệnh.
+ Cốđịnh bằng dung dịch Formol 10%.
+ Sau khi cố định, rửa tổ chức dưới vòi nước chảy nhẹ từ 12 - 24 giờ để loại bỏ Formol có trong tổ chức.
+ Khử nước: Dùng cồn tuyệt đối để rút nước trong bệnh phẩm ra. + Làm trong tiêu bản: Ngâm bệnh phẩm qua hệ thống Xylen.
+ Tẩm parafin: Ngâm bệnh phẩm đã làm trong vào các cốc đã đựng parafin nóng chảy, đểở tủấm nhiệt độ 560C.
+ Đổ Block: Rót parafin nóng chảy vào khuôn giấy rồi đặt miếng tổ chức (bệnh phẩm) đã tẩm parafin vào. Khi parafin đông đặc hoàn toàn thì bóc khuôn. Sửa lại Block cho vuông vắn.
+ Cắt và dán mảnh: Cắt bệnh phẩm trên máy cắt microtocom, độ dày mảnh cắt 3 - 4 µm. Dán mảnh cắt lên phiến kính bằng dung dịch Mayer (lòng trắng trứng gà 1 phần, glyxeril 1 phần; 1 ml hỗn hợp trên pha trong 19 ml nước cất).
+ Nhuộm tiêu bản bằng phương pháp Hematoxilin- eosin. Phương pháp như sau: Tẩy nến bằng Xylen, sau đó ngâm tiêu bản tổ chức vào cồn Ethanol 96% trong 5 phút. Tiêu bản tổ chức được rửa dưới dòng nước chảy nhẹ trong 5 phút và nhuộm Hematoxilin trong 5 phút, sau đó lại rửa nước trong 15 phút và nhuộm Eosin trong 1 - 2 phút. Rửa dưới dòng nước chảy nhẹ, làm khô tiêu bản trong dung dịch cồn có nồng độ tăng dần 96% đến 100% với thời gian giảm dần từ 5 phút đến 2 phút.
+ Gắn lamen bằng Baume - Canada, dán nhãn và đọc kết quả dưới kính hiển vi quang học.
2.3.4. Đề xuất biện pháp phòng chống bệnh DTLCP tại tỉnh Quảng Ninh
- Dựa vào tình hình thực tế tại tỉnh Quảng Ninh;
- Dựa vào kinh nghiệm của các nước và khuyến cáo của các tổ chức quốc tế - Dựa vào văn bản chỉ đạo, điều hành của chính phủ, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn
2.4. Phương pháp xử lý số liệu
2.4.1. Một số tham số thống kê
Số liệu thu thập được được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học (Nguyễn Văn Thiện, 2008), trên phần mềm Minitab 1.2; Excel 2016.
- Số trung bình ==n1 i i X X n - Sai số của số trung bình: ( 30) 1 =± ≤ − X X S m n n ( 30) = ± X > X S m n n - Độ lệch tiêu chuẩn: 2 2 1 1 1 = = − = − n i n i i i X X X n S n (n ≤ 30)
2 2 1 1 1 = = − = − n i n i i i X X X n S n (n > 30) Trong đó: X : Số trung bình n : Dung lượng mẫu mx : Sai số của số trung bình Sx : Độ lệch tiêu chuẩn Xi : Giá trị của mẫu (i = 1, 2, 3...n) 1 n i= : Tổng giá trị X 2.4.2. So sánh mức độ sai khác giữa 2 số trung bình
Đối với các tính trạng định lượng giữa 2 nhóm (số lượng hồng cầu, số lượng bạch cầu, hàm lượng huyết sắc tố) Các bước tiến hành như sau: - Bước 1: Tính tTN. + Trường hợp mẫu nhỏ: n1 + n2 < 30 và n1 ≠ n2 ( ) ( ) 1 2 TN 2 2 1 1 2 2 1 2 1 2 |X -X | t = n -1 .S + n -1 S 1 1 . + n +n -2 n n Trong đó: 1 X và X2: Số trung bình của nhóm 1 và 2. n1 và n2: Dung lượng mẫu của nhóm 1 và 2. S1 và S2: Độ lệch tiêu chuẩn của nhóm 1 và 2. + Trường hợp mẫu nhỏ n1 + n2 < 30 và n1 = n2 1 2 1 2 T N 2 2 X X |X - X | t = m + m
Trong đó: m2X1và 2 2 X m : Sai số của số trung bình nhóm 1 và 2. + Trường hợp n1 + n2 > 30 1 2 1 2 TN 2 2 X X |X -X | t = m + m Trong đó: m2X1 và 2 2 X m : Sai số của số trung bình nhóm 1 và 2. + Bước 2: Tìm t∝ ứng với độ tự do γ và các mức xác suất khác nhau: 0,05 - 0,01 và 0,001. (γ = n1 + n2 - 2).
+ Bước 3: So sánh tTN với t∝để tìm xác suất xuất hiện giá trị tTN hoàn toàn do ngẫu nhiên sinh ra.
+ Bước 4: Xác định mức độ sai khác nhau giữa hai số trung bình.
2.5. Phương pháp xây dựng bản đồ.
- Cơ sở toán học bản đồ dịch tễ: Tỉ lệ: 1: 100.000
Ellipsoid: WGS 84
Lưới chiếu: UTM Múi chiếu: 60 Kinh tuyến trục: 107045' Hệ số ko: 0,9999
Hệ tọa độ: Quốc gia VN 2000 Hệđộ cao: Quốc gia Việt Nam
- Bản đồ nền: Bản đồ địa giới hành chính tỉnh Quảng Ninh tỷ lệ 1:100.000, Bản đồ hiện trạng sử dụng đất tỉnh Quảng Ninh năm 2014 tỷ lệ 1:100.000.
- Khoanh vùng nội nghiệp các khu vực dự kiến lấy mẫu xét nghiệm trên cơ sở các loại tài liệu đã thu thập như: Bản đồ địa giới hành chính tỉnh Quảng Ninh tỷ lệ 1:100.000, Bản đồ hiện trạng sử dụng đất tỉnh Quảng Ninh năm 2014 tỷ lệ 1:100.000.
- Điều tra ngoại nghiệp: Sử dụng máy GPS xác định vị trí cần lấy mẫu xét nghiệm, ký hiệu điểm lấy mẫu, tọa độ lấy mẫu.
- Biên tập nội nghiệp:
+ Biên tập bản đồ dịch tễ và xuất bảng biểu tổng hợp. Thu thập các loại bản đồ nền bao gồm: Bản đồ địa giới hành chính tỉnh Quảng Ninh tỷ lệ 1:100.000, bản đồ
hiện trạng sử dụng đất tỉnh Quảng Ninh năm 2014 tỷ lệ 1:100.000. Tất cả bản đồ nền thu thập đều định dạng file .*dgn được chuyển sang môi trường làm việc của Mapinfor V17 *Tab sử dụng phần mềm FME 2013.
+ Biên tập bản đồ trên phần mềm Mapinfor V17. Xây dựng lớp thông tin chuyên đề dịch tễ bao gồm các trường thông tin như vị trí lấy mẫu, kết quả xét nghiệm mẫu...
Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Thực trạng chăn nuôi lợn của tỉnh Quảng Ninh giai đoạn 2016 - 2020
Chăn nuôi lợn là ngành chăn nuôi truyền thống, gắn bó từ lâu đời với người nông dân. Những năm qua, do cơ cấu phát triển kinh tế, tình hình dịch bệnh mà ngành chăn nuôi lợn của tỉnh Quảng Ninh có nhiều biến động cả về quy mô đàn cũng như đầu con. Đặc biệt trong năm 2019, bệnh dịch tả lợn châu Phi nổ ra trên phạm vi cả nước nói chung, tỉnh Quảng Ninh nói riêng gây lên sự biến động lớn về đầu con và gây thiệt hại nặng về kinh tế. Để biết được tình hình chăn nuôi lợn tại tỉnh Quảng Ninh, chúng tôi đã tiến hành tổng hợp về tình hình chăn nuôi lợn từ Cục Thống kê, Chi cục Chăn nuôi và Thú y tỉnh Quảng Ninh từ năm 2016 - 2020. Kết quảđược trình bày qua bảng 3.1.
Bảng 3.1. Thực trạng chăn nuôi lợn của tỉnh Quảng Ninh giai đoạn 2016 - 2020 Năm Tổng đàn vật nuôi (con) Tổng đàn lợn (con) Tốc độ tăng trưởng (%) 2016 3.815.429 417.524 102,61 2017 3.946.020 423.793 101,50 2018 4.053.863 430.982 101,70 2019 3.978.541 228.841 53,10 Nửa đầu 2020 3.779.595 265.200 115,89
Qua bảng 3.1 cho thấy: trong 3 năm 2016 đến 2018 số lượng lợn của tỉnh Quảng Ninh tăng lên (năm 2016 tổng đàn lợn là 417.524 con thì đến năm 2017 và 2018 lần lượt 423.793 con và 430.982 con). Đến năm 2019, tổng đàn lợn giảm đi rất