3. Ý nghĩa khoa học và thực tiển của luận văn
1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC
1.4.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
-Năm 2008, Devaraj KB và cộng sự đã tinh sạch và khảo sát một số tính chất của ficin từ sung tây. Nghiên cứu thu nhận chế phẩm ficin đã tiến hành tinh sạch enzyme từ nhựa quả sung bằng các phương pháp sắc kí, điện di để thu được enzyme tinh sạch đồng thời khảo sát nhiệt độ và pH thích hợp cho hoạt độ của chúng [22].
Cũng cùng chủ đề này, Nison Sattaya cũng nghiên cứu lĩnh vực này trên đối tượng cây sung được trồng tại Thái Lan vào năm 2012 [26].
-Năm 2012, Hamid Zare và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu xác định hàm lượng protease và tiến hành tinh sạch ficin có trong dịch nhựa. Hamid Zare đã sử dụng phương pháp Bradford để xác định hàm lượng protein còn phương pháp sắc kí để tinh sạch enzyme ficin [23].
-Năm 2014, Mohammed Gagaoua và cộng sự, đã xác định được nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt tính xúc tác của enzyme ficin thu nhận từ quả vả [25].
-Năm 2014, Danielle Baeyens-Volant và cộng sự, đã tiến hành nghiên cứu phương pháp tinh sạch và tìm hiểu về đặc tính của protease trên nhựa vả. Nghiên cứu này sử dụng phương pháp tinh sạch bằng điện di mini SDS và phương pháp sắc ký lọc gel để xác định phân tử lượng của enzyme protease trong nhựa vả. Ngoài ra, nghiên cứu cũng đã xác định được nhiệt độ và pH tối ưu của protease [21].
1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
-Năm 2012, trong Công nghệ enzyme của Nguyễn Đức Lượng giới thiệu các phương pháp tách chiết và tinh sạch enzyme ficin có trong nhựa quả sung. Đối với phương pháp tách chiết Nguyễn Đức Lượng sử dụng dung môi hữu cơ và muối để kết tủa protease, sau đó tiến hành tinh sạch enzyme bằng phương pháp sắc kí lọc gel sephadex G75 [10].
Hiện tại ở Việt Nam vẫn chưa có công trình nghiên cứu nào về enzyme ficin trong quả vả được công bố, phần lớn các đối tượng nghiên cứu chỉ tập trung ở papain trong quả đu đủ, bromelain trong quả dứa. Mặc dù, ở nước ngoài đã có nhiều nghiên cứu về enzyme ficin trong nhựa vả. Nhu cầu sử dụng các nguồn enzyme từ thực vật ứng dụng trong thực phẩm rất lớn chúng ta chủ yếu nhập từ nước ngoài nên giá thành rất cao. Vì vậy, việc hiểu biết, nghiên cứu, phát triển thu nhận chế phẩm enzyme ficin trong nước là việc rất cần thiết và là một ngành công nghiệp đầy tiềm năng.
* Tính mới của đề tài
Thứ nhất: với tình hình trong và ngoài nước như đã trình bày ở trên ta thấy được vẫn chưa có nhiều sự quan tâm trong nước đối với loại enzyme ficin trong quả vả. Trong khi đó, các enzyme khác như bromaline, papain đã được nghiên cứu và ứng dụng.
Thứ hai: bước đầu ứng dụng vào trong quá trình làm mềm thịt, sẽ mở ra một cái nhìn mới đối với các nhà nghiên cứu về ứng dụng của enzyme ficin.
Thứ ba: muốn giới thiệu đến với mọi người và giúp mọi người biết đến quả vả nhiều hơn cũng như biết được giá trị khi sử dụng chúng trong đời sống. Có thể ứng dụng trực tiếp vào trong các bữa ăn hằng ngày.
CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. PHẠM VI, ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu tại phòng thí nghiệm Viện Công nghệ Sinh học – Đại học Huế và phòng thí nghiệm Công nghệ thực phẩm – Khoa Cơ khí - Công nghệ, Trường Đại học Nông Lâm Huế.
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu
- Dịch nhựa quả vả được thu nhận ở ba giai đoạn thu hoạch khác nhau (quả non, quả vừa chín tới, quả thu hoạch) trên địa bàn Tỉnh Thừa Thiên Huế.
Hình 2.1. Dịch nhựa thu nhận từ ba giai đoạn thu hoạch của quả vả
- Thịt bò được thu mua tại lò giết mổ Hương An, thị xã Hương Trà và Thủy Xuân, thành phố Huế.
2.1.3. Hóa chất
-Dung môi: aceton, ethanol 96%, nước cất
-Dung dịch đệm phosphate 0,1M, pH = 7
-Dung dịch HCl 0,1M
-Dung dịch albumin chuẩn. - Thuốc thử Bradford, folin
-Na2CO3
-Tyrosin tinh khiết
-Dung dịch TCA 0,4M
Phần lớn hóa chất trên là những loại được sản xuất ở hãng Merk và Bio-rad.
2.1.4. Một số thiết bị chính
-Thiết bị ly tâm lạnh: hiệu Himac (R22G High Speed Refrigerated Cetrifuge – Nhật Bản).
-Máy quang phổ
-Thiết bị đo pH: hiệu Hansan – Ý
-Tủ lạnh: hiệu Toshiba – Nhật
-Tủ sấy: hiệu Memmert - Đức
-Cân phân tích: hiệu Satorius – Đức
-Máy khuấy từ: hiệu IKA C-MAG HS10 – Đức
-Máy vortex mixer: hiệu Pioway – Trung Quốc
-Máy đo độ dai WDS-1
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.2.1. Nghiên cứu thu nhận chế phẩm ficin từ nhựa quả vả
+ Khả năng thu nhận nhựa quả vả: độ dày vết cắt, độ sâu, thời gian nhiệt độ. + Khảo sát đối tượng thu nhận: quả non, quả thu hoạch,quả già.
+ Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng kết tủa protein: dung môi, tỷ lệ dịch nhựa/dung môi, thời gian và nhiệt độ kết tủa.
2.2.2. Khảo sát một số tính chất đặc trưng ảnh hưởng đến hoạt tính của chế phẩm ficin
+ Nhiệt độ, pH hoạt động + Khả năng bền nhiệt
2.2.3. Bước đầu khảo sát khả năng làm mềm thịt bò
+ Khảo sát độ dai của thịt bò + Khảo sát tỷ lệ mất nước của thịt
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp tách chế phẩm ficin từ nhựa vả
2.3.1.1. Quy trình tách nhựa từ quả vả
Hình 2.3. Sơ đồ quy trình thu nhận dịch nhựa từ quả vả [9], [10]
* Thuyết minh quy trình:
Dịch nhựa được thu nhận khi quả vả vừa mới thu hoạch vào buổi sáng sớm. Dùng bình tam giác đặt trong xô đá để hứng lấy dịch nhựa chảy ra từ cuống quả vả. Tiếp tục cắt thêm một đoạn khoảng 0,5 – 1cm trên cuống quả để tận thu dịch nhựa. Lưu ý, trong quá trình cắt cuống không được cắt thâm vào thịt quả quá 2cm [10]. Ngoài ra, tránh nhiễm bụi, tạp chất, kim loại, tránh ánh sáng và luôn giữ ở điều kiện lạnh để tránh ảnh hưởng đến hoạt độ của enzyme trong quá trình thu nhận. Sau đó, dịch nhựa từ quả vả (gọi là nhựa vả) nhanh chóng đem về phòng thí nghiệm bảo quản ở nhiệt độ < 5ºC.
Cây vả
Trái vả còn cuống
Cắt cuống
Lấy nhựa giữa cuống và quả (điều kiện lạnh)
2.3.1.2. Quy trình tách enzyme ficin từ nhựa quả vả.
Hình 2.4. Quy trình thu nhận chế phẩm enzyme ficin từ nhựa quả vả [9], [10], [25]
Quả vả
Khấy từ (100 vòng/phút, 5
phút)
Ly tâm thu tủa (10000 vòng/phút,
4oC10phút) Dịch nổi Lấy nhựa (điều kiện lạnh)
Hòa tan trong nước cất Ly tâm (4000 vòng/phút, 4oC) Bảo quản enzyme Kết tủa protein Chế phẩm enzyme Dung môi Nước cất Tạp chất cặn bẩn Dung môi
* Thuyết minh quy trình:
Dịch nhựa thu được bảo quản ở nhiệt độ đông (-20ºC) sau đó ta đem xuống ngăn lạnh trước khi tiến hành thu nhận enzyme ficin. Tiến hành hòa tan dịch nhựa với nước cất bằng cách cân 5g dịch nhựa hòa với nước cất tỉ lệ 1/2 [5]. Sử dụng máy khuấy từ (100 vòng/phút), trong thời gian 2 – 3 phút để tạo điều kiện cho quá trình hòa tan được triệt để. Tiếp theo, dung dịch được tách tạp chất và các phần không tan bằng máy ly tâm lạnh (4000 vòng/phút, trong 10 phút). Sau khi ly tâm ta loại bỏ lớp cặn dưới đáy và một phần dịch trắng đục nổi lên trên bề mặt, chỉ thu phần dịch ở giữa để tiến hành kết tủa protein. Tại giai đoạn kết tủa bằng dung môi hữa cơ ta tiến hành khảo sát các loại dung môi (ethanol, aceton) cần tủa, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (1/1, 1/2, 1/3, 1/4 và 1/5), thời gian (30 phút, 60 phút và 90 phút), nhiệt độ (1ºC, 3ºC và 5ºC) kết tủa. Dựa vào phương pháp loại suy chúng tôi sẽ lựa chọn các thông số thích hợp cho quá trình kết tủa protein có trong dịch nhựa. Để thu nhận tủa protein chúng tôi tiến hành ly tâm lạnh (10000 vòng/phút, 10 phút, 4oC). Sau khi ly tâm lượng kết tủa sẽ lắng xuống dưới và được tách bằng cách lọc hoặc hút. Sau đó, làm khô tủa từ 2 giờ – 3 giờ trong điều kiện lạnh. Kết tủa thu được đem đi hòa trong dung dịch đệm phosphat để tiến hành đo hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford và hoạt độ protease bằng phương pháp Amano.
2.3.2. Phương pháp xác định hàm lượng protein
Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford sẽ được trình bày chi tiết ở phụ lục 1.1.
Nguyên tắc: phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thụ cực đại và sự thay đổi màu xảy ra khi Coomasie Brilliant Blue liên kết với protein trong dung dịch acid. Trong dung dịch mạnh tính acid, khi không kết nối với protein thì thuốc nhuộm có bước sóng cực đại ở 465nm. Khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thụ bước sóng cực đại ở 595nm. Nhờ đó mà xác định được nồng độ protein. Dạng proton hóa của thuốc nhuộm Coomasie Brilliant Blue có màu xanh. Thuốc nhuộm liên kết chặt chẽ với các protein, tương tác với tất cả các nhóm kỵ nước và các nhóm mang điện tích dương trên phân tử protein. Trong môi trường của gốc mang điện tích dương, sự proton hóa không xảy ra và màu xanh xuất hiện. Màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và ổn định trong gần một giờ [4], [5]. Xây dựng đường chuẩn Albumin, từ đó xác định hàm lượng protein trong V(ml) để chế phẩm thô được tính theo công thức:
mgprotein = b*10-3*m*V (CT1) Trong đó
b: nồng độ protein trong mẫu suy ra từ đường chuẩn (mg/ml). m: hệ số pha loãng.
µgtyrozin × 0,8
t
2.3.3. Phương pháp xác định hoạt độ protease
Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Amano được trình bày ở phụ lục 1.2 [2], [11].
Nguyên tắc: protein (casein) làm cơ chất. Xác định độ hoạt động phân giải protein của enzyme trên cơ sở xác định lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng, bằng phản ứng màu với thuốc thử folin – clocalteau. Dựa vào đồ thị đường chuẩn, định lượng tyrosin tương ứng với lượng sản phẩm thủy phân dưới tác dụng của enzyme.
Đơn vị hoạt động của proteolitic (casein) là lượng enzyme mà trong 60 phút ở 30ºC có khả năng phân giải protein tạo các sản phẩm hòa tan trong trichloroacetic, cho phản ứng màu với thuốc thử folin – clocalteau. Dựa vào đồ thị đường chuẩn, định lượng tyrosin tương ứng với 1µg tyrosin. Hoạt độ riêng của các chế phẩm được biểu diễn bằng số đơn vị hoạt động proteolitic trên 1ml protein chế phẩm [22]. Xây dựng đồ thị chuẩn tyrosin và dựa vào đồ thị đường chuẩn tính lượng µg tyrozin tương ứng.
Tính số đơn vị hoạt động proteolitic của 0,2ml dung dịch enzyme đã lấy xác định hoạt độ theo công thức:
Hp/ml = (đơn vị) (CT2) Trong đó:
0,8: thể tích toàn bộ hỗn hợp phản ứng (0,2ml cơ chất, 0,2ml dung dịch enzyme, 0,4ml dung dịch TCA (acid trichloroacetic)).
t: thời gian để enzyme tác dụng với cơ chất (30 phút).
2.3.4. Phương pháp vật lý
+ Xác định pH bằng máy đo pH điện tử hiệu Hansan – Ý. + Đo mật độ quang trên máy đo quang phổ: UV- Nhật Bản.
2.3.5. Phương pháp cơ học
Sử dụng các biện pháp xử lý cắt cuốn để thu dịch nhựa từ quả. Phương pháp lọc, ly tâm để tách dịch nhựa.
2.3.6. Phương pháp xác định độ mềm thịt bò
2.3.6.1. Cách lấy mẫu
Mẫu thịt bò (longissimus dorsi) được lấy tại hai cơ sở giết mổ gia súc: tại Hương An, thị xã Hương Trà và tại Thủy Xuân, thành phố Huế. Sau 2 giờ giết thịt, mẫu được xử lý và phân tích độ dai và các chỉ tiêu liên quan như tỷ lệ mất nước và màu sắc của thịt bò. Các chỉ tiêu được theo dõi sau 0, 5, 10, 15 và 20 phút sau khi bổ sung chế
phẩm ficin và bên cạnh đó, mẫu đối chứng được tiến hành song song. Các chỉ tiêu phân tích được tiến hành tại phòng thí nghiệm của khoa Chăn nuôi - Thú y, trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế.
2.2.6.2. Xác định độ dai
Độ dai của thịt bò được xác định theo phương pháp của Honikel và cộng sự (1998). Đo độ dai tại 5 vị trí khác nhau trên mẫu (mẫu trước và sau luộc) phép đo được lặp lại 5 lần. Sử dụng máy đo độ dai WDS-1 với tốc độ lưỡi dao 300mm/phút.
Hình 2.5. Máy đo độ dai WDS-1 2.2.6.3. Xác định độ mất nước chế biến
Độ mất nước chế biến được xác định theo phương pháp Bouton và cộng sự (1971). Cân 10 g mẫu thịt (4 cm x 2 cm x 0,5 cm) và cho vào túi chịu nhiệt. Luộc trong thiết bị water bath (WNB10) ở 95oC trong 3 phút, sau đó làm mát dưới vòi nước chảy 5 phút. Lấy thịt ra khỏi túi, làm khô bằng khăn gạc mềm và cân khối lượng mẫu. Công thức tính tỷ lệ mất nước chế biến:
TL mất nước chế biến (%) =
m trước chế biến - m sau chế biến
100 m trước chế biến
2.3.7. Phương pháp toán học
Số liệu tính toán bằng bằng chương trình Microsoft Excel và đựơc xử lý bằng phần mềm Minitab 16.2.0.
2.3.8. Phương pháp bố trí thí nghiệm
2.3.8.1. Thí nghiệm 1
Nghiên cứu ảnh hưởng của độ già chín đến hàm lượng protein và hoạt độ protease của dịch nhựa quả vả.
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi mẫu thực hiện với 3 lần lặp. Các mẫu được thực hiện trong cùng điều kiện. Sau đó, xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford và hoạt độ protease theo phương pháp Amano để lựa chọn thời điểm thu hoạch dịch nhựa.
2.3.8.2. Thí nghiệm 2
Khảo sát lựa chọn dung môi (ethanol 96% và aceton) sử dụng để kết tủa protein trong dịch nhựa quả vả.
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi mẫu thực hiện với 3 lần lặp. Các mẫu được thực hiện trong cùng điều kiện.
Thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ hình 2 (mục 1.3.2, phụ lục 1).
2.3.8.3. Thí nghiệm 3
Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dịch nhựa/dung môi kết tủa đến hàm lượng protein và hoạt độ protease. Thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ hình 3 (mục 1.3.3, phụ lục 1).
2.3.8.4. Thí nghiệm 4
Khảo sát thời gian kết tủa ảnh hưởng đến hàm lượng protein và hoạt độ protease. Thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ hình 4 (mục 1.3.4, phụ lục 1).
Sau đó xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford và hoạt độ protease theo phương pháp Amano để lựa chọn thời gian kết tủa thích hợp để thu nhận chế phẩm protease từ dịch nhựa quả vả.
2.3.8.5. Thí nghiệm 5
Khảo sát nhiệt độ kết tủa ảnh hưởng đến hàm lượng protein và hoạt độ của protease.
Thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ hình 5 (mục 1.3.5, phụ lục 1).
Sau đó xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford và hoạt độ protease theo phương pháp Amano để lựa chọn nhiệt độ kết tủa thích hợp để thu nhận chế phẩm protease từ dịch nhựa quả vả.
2.3.8.6. Thí nghiệm 6
Khảo sát nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính của protease [25], [26]. Thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ hình 6 (mục 1.3.6, phụ lục 1).
Sau đó xác định hoạt độ protease theo phương pháp Amano để lựa chọn nhiệt độ thích hợp cho hoạt độ của chế phẩm protease từ dịch nhựa quả vả.
2.3.8.7. Thí nghiệm 7
Phương pháp tiến hành khảo sát pH thích hợp cho hoạt tính của protease [25], [26].
Thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ hình 7 (mục 1.3.7, phụ lục 1).
Sau đó xác định hoạt độ protease theo phương pháp Amano để lựa chọn pH thích hợp cho hoạt độ của chế phẩm protease từ dịch nhựa quả vả.
2.3.8.8. Thí nghiệm 8
Phương pháp tiến hành khảo sát độ bền nhiệt độ của enzyme protease [13]. Thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ hình 8 (mục 1.3.8, phụ lục 1).
Sau đó xác định hoạt độ protease theo phương pháp Amano để lựa chọn khoảng nhiệt độ cho độ bền của chế phẩm protease từ dịch nhựa quả vả.
2.3.8.9. Thí nghiệm 9
Phương pháp tiến hành khảo sát khả năng làm mềm thịt bò của chế phẩm ficin. Thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ hình 9 (mục 1.3.9, phụ lục 1)
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. HÀM LƯỢNG PROTEIN VÀ HOẠT ĐỘ PROTEASE Ở BA GIAI ĐOẠN THU HOẠCH KHÁC NHAU CỦA QUẢ VẢ