3. Ý nghĩa khoa học và thực tiển của luận văn
3.7.2. Khảo sát tỷ lệ mất nước của thịt
Các thí nghiệm được bố trí tương tự như xác định độ dai của thịt, kết quả được thể hiện ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của chế phẩm ficin đến tỷ lệ mất nước của thịt bò
Tỷ lệ mất nước (%)
Thời gian ướp thịt (phút)
0 5 10 15 20
ĐC 22,64a 24,60b 24,90b 25,37bc 25,13b
Có bổ sung chế phẩm 22,64c 24,75d 19,13b 18,70ab 17,33a
* ĐC : đối chứng, thịt không bổ sung chế phẩm
Ghi chú: Các chữ cái a, b, c, d thể hiện sự sai khác có nghĩa thống kê theo hàng của bảng biểu đối với tỷ lệ mất nước của thịt khi không hoặc có bổ sung chế phẩm ficin.
Qua bảng số liệu cho thấy tỷ lệ mất nước của thịt tăng theo thời gian đối với mẫu đối chứng từ 22,64% đến 25,13% sau 20 phút trong điều kiện phòng thí nghiệm. Trong khi đó, mẫu có bổ sung chế phẩm ficin phần nào hạn chế tỷ lệ mất nước của thịt, sau 20 phút tỷ lệ giảm còn 17,33%. Điều này có thể giải thích, chế phẩm ficin đã xúc tác làm đứt các mạch polypeptit dài tạo thành các mạch ngắn hơn, tạo điều kiện liên kết với các phân tử nước nhiều hơn. Ngoài ra, chế phẩm ficin có khả năng phá vỡ cấu trúc mô protein liên kết thông qua đó bổ sung phân tử nước, do đó có thể làm cho tỷ lệ nước trong thịt giảm đi không đáng kể.
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. KẾT LUẬN
Qua quá trình nghiên cứu, chúng tôi đưa ra một số kết luận ở quy mô phòng thí nghiệm như sau:
- Xây dựng được đường chuẩn albumin và tyrosin cho việc xác định hàm lượng protein và hoạt độ protease phục vụ cho mục đích của đề tài nghiên cứu.
- Hàm lượng protein đạt 2,122 (mg/ml) và hoạt độ protease đạt 1,015 (Hp/ml) khi các thông số kỹ thuật ảnh hưởng đến quá trình thu nhận được lựa chọn như sau:
+ Đã khảo sát được sự có mặt của protein trong dịch nhựa của 3 giai đoạn thu hoạch khác nhau của quả vả nghiên cứu: quả non, quả thu hoạch, quả già chín. Và nhận thấy dịch nhựa từ quả vả thu hoạch chứa nhiều enzyme protease nhất.
+ Chọn được ethanol 96% là dung môi hữu cơ sử dụng để kết tủa protein thích hợp và tỷ lệ dịch nhựa/ethanol 96% là 1/4.
+ Khảo sát được nhiệt độ kết tủa protein thích hợp là 3ºC và thời gian kết tủa trong 60 phút.
- Khảo sát được một số tính chất của chế phẩm ficin: Nhiệt độ thích hợp ở 45ºC, pH = 6 và độ bền nhiệt của chế phẩm ficin nằm trong khoảng từ 35ºC - 50ºC trong thời gian 60 phút.
- Bước đầu khảo sát khả năng làm mềm thịt của chế phẩm ficin (độ dai của thịt bò đạt 50,60 N và tỷ lệ mất nước giảm còn 17,33% sau 20 phút).
5.2. KIẾN NGHỊ
Các kết quả nghiên cứu trên đây chỉ mới là những nghiên cứu bước đầu của quá trình thu nhận chế phẩm protease và khảo sát một số tính chất của enzyme protease ở đối tượng nghiên cứu là nhựa của quả vả. Do vậy, chúng tôi có một vài kiến nghị về hướng phát triển của đề tài như sau:
- Tối ưu hóa các điều kiện thiết lập nên một quy trình protease từ nhựa vả thật hoàn chỉnh.
- Tiếp tục xây dựng quy trình tinh chế enzyme ficin trong nhựa quả vả, đi sâu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình tách và tinh chế enzyme, đồng thời kiểm tra hoạt độ enzyme sau khi tinh chế.
- Nghiên cứu sâu hơn việc ứng dụng enzyme ficin vào ngành công nghiệp làm mềm thịt nói riêng và vào công nghệ thưc phẩm nói chung.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt
[1]. Hoàng Kim Anh, Trần Ngọc Hiếu, 2011, Ứng dụng enzyme trong công nghệ thực phẩm, NXB Khoa học - Kỹ thuật.
[2]. Nguyễn Trọng Cẩn (chủ biên), Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến, 1998, Công nghệ enzyme, NXB Nông nghiệp – TP. Hồ Chí Minh.
[3]. Nguyễn Hữu Chấn, 1996, Enzyme và xúc tác sinh học, NXB y học.
[4]. Phạm Thị Trân Châu, Trịnh Hồng Thái (1995). Tinh sạch và nghiên cứu một số tính chất của proteinase ở sâu xanh, Heliothis armigera. Tạp chí khoa học Đại Học Quốc gia Hà Nội, 6(1), tr. 42-50.
[5]. Lê Nguyễn Đoan Duy, Huỳnh Thị Phương Thảo, Nguyễn Công Hà, 2014,
Khảo sát quá trình sinh tổng hợp protease từ Aspergillus oryzae trên môi trường bán rắn, Tạp chí khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 33, 104 – 109.
[6]. Quách Đĩnh, Nguyễn Văn Tiếp, Nguyễn Văn Thoa, 1996, Công nghệ sau thu hoạch và chế biến rau quả, NXB Khoa học - Kỹ thuật.
[7]. Nguyễn Lệ Hà, 2015, Protease tinh sạch từ tôm sú Penaeus monodon và một số tính chất cơ bản, Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản.
[8]. Trần Quốc Hiền, Lê Văn Việt Mẫn, 2016, Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme protease từ ruột cá Basa (Pangasius bocourti), Tạp chí phát triển KH & CN, tập 9, số 11.
[9]. Lê Gia Hy, Lỗ Tiến Sỹ, Phạm Kim Dung, Trương Nam Hải (1999), . Nghiên cứu lên men sản xuất proteinase kiềm từ chủng xạ khuẩn ưa kiềm CD 2-1 phân lập ở Việt Nam. Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 2000, 3, tr. 12-16.
[10]. Nguyễn Đức Lượng (chủ biên), Cao Cường, Nguyễn Ánh Tuyết, Lê Thị Thủy Tiên, Huỳnh Ngọc Oanh, Nguyễn Thúy Hương, Phan Thị Huyền, Tạ Thu Hằng, 2012, Công nghệ enzyme, NXB Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.
[11]. Nguyễn Văn Mùi, 2001, Thực hành hóa sinh, NXB Quốc gia Hà Nội.
TPHCM.
[13]. Quyền Đình Thi, Trần Thị Quỳnh Anh, 2007, Một số tính chất của protease ngoại bào chủng vi sinh vật biến Acinetobacter SP. QN6, Tạp chí Công nghệ sinh học 5 (2): 197:203.
[14]. Đỗ Thị Bích Thủy, 2011, Hóa sinh thực phẩm, NXB Đại học Huế.
[15]. Đỗ Thị Bích Thủy, 2006, Nghiên cứu thu nhận chế phẩm protease từ một số nguồn khác nhau và ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, Nhà xuất bản Đại học Đà Nẵng
[16]. Lê Ngọc Tú, La Văn Chư, Phạm Trân Châu, Nguyễn Văn Dũng, 1982,
Enzyme vi sinh vật, NXB Khoa học - Kỹ thuật.
[17]. Lê Ngọc Tú, 2010, Hóa sinh công nghiệp, NXB Khoa học - Kỹ thuật.
[18]. Nguyễn Thị Cẩm Vi, 2011, Khảo sát sự biến đổi hàm lượng protein hòa tan và hoạt tính bromelain trong quá trính phát triển của quả dứa, Tạp chí Khoa học - Ứng dụng.
Tài liệu tiếng Anh
[19]. Bouton P.E., Harris P.V., Shorthose W.R., 2001. Effec of ultimate pH upon the water-holding capacity and tenderness of mutton. Journal of food science 36, 435-439
[20]. Bradford MM, 1976, A rapid and sensitive mocrogram quantities of protein utilizing the priciple of protein dye biding, Anal. Biochem, 72: 248 – 254.
[21]. Danielle Baeyens-Volant, Andre Matagne, Rachida El Mahyaoui, Ruddy Wattiez, 2015, A novel form of ficin from Ficus carica latex: Purification and characterization, Phytochemistry 117 (2015) 154–167.
[22]. Devaraj, K.B., Kumar, P.R., Prakash, V., 2008, Purification, characterization and solvent-induced thermal stabilization of ficin from Ficus carica, J. Agric. Food Chem. 56, 11417–11423.
[23].
[24].
Hamid Zare, Ali Akbar Moosavi-Movahedi, Maryam Salami, Morteza Mirzaei, Ali Akbar Saboury, Nader Sheibani, 2012, Purification and autolysis of the ficin isoforms from fig (Ficus carica cv. Sabz) latex, Phytochemistry.
Honikel K.O., 1998. Reference methods for the Assessment of Physical Characteristics of Meat. Meat science 49 (4), 447-457
[25]. Mohammed Gagaoua et al, 2014, Three-phase partitioning as an efficient method for the purification and recovery of ficin from Mediterranean fig (Ficus carica L.) latex.
[26]. Nison Sattayasai (2012), Protein Purification, Khon Kaen University Thailand.
[27]. Jones, I.K., Glazer, A., 1970. Comparative studies on four sulfhydryl endopeptidases (‘‘ficins’’) of Ficus glabrata latex. J. Biol. Chem. 245, 2765–2772.
[28]. Kramer, D.E., Whitaker, J.R., 1964. Ficus enzymes II, Properties of the proteolytic enzymes from the latex of Ficus carica variety kodata. J. Biol. Chem. 239, 2178– 2183.
[29]. Kramer, D.E., Whitaker, J.R., 1969, Nature of conversion ofFicus carica variety kadota ficin component D to component C. Some physicochemical properties of components C and D.Plant Physiol, 44, 1566–1573.
[30]. Singh, V.K., Patel, A.K., Moir, A.J., Jagannadham, M.V., 2008, Indicain, a dimeric serine protease from Morus indica cv. K2. Phytochemistry 69, 2110–2119.
[31]. Ramos, M.V., Araújo, E.S., Jucá, T.L., Monteiro-Moreira, A.C., Vasconcelos, I.M., Moreira, R.A., Viana, C.A., Beltramini, L.M., Pereira, D.A., Moreno, F.B., 2013, New insights into the complex mixture of latex cysteine peptidases in Calotropis procera. Int. J. Biol. Macromol. 58, 211– 219.
[32]. Torres, M.J., Trejo, S.A., Obregón, W.D., Avilés, F.X., López, L.M., Natalucci, C.L., 2012, Characterization of the proteolytic system present in Vasconcellea quercifolia latex. Planta 236, 1471–1484.
[33]. Turk, B., 2006. Targeting proteases: successes, failures and future prospects. Nat. Rev. Drug Discov. 5, 785–799. Vander Hoorn, R.A.L., 2008, Plant proteases: from phenotypes to molecular mechanisms, Annu. Rev. Plant Biol. 59, 191–223.
[34]. William MF, 1983, Microbial Enzyme and Biotechnology. Applied Science Publishers London and New York.
Tài liệu trang web [35]. http://blogtamsu.vn/cong-dung-chua-benh-cua-nhua-sung-it-nguoibiet.html. [36]. http://hoala.vn/product-detail/2847/cay- va.html. [37]. https://plus.google.com/102827822611566078241/posts/4KkfvqrAkc [38]. http://travahue.com/nguon-goc-trai-va/ [39]. [40]. https://vi.wikipedia.org/wiki/V%E1%BA%A3 http://www.vncreatures.net/chitiet.php?page=1&loai=2&ID=2533
PHỤ LỤC
PHỤ LỤC 1 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1.1. Phương pháp xác định hàm lượng protein [4], [17]
Bradford là một trong những phương pháp để xác định hàm lượng protein. Phương pháp này có một số ưu điểm như sau:
- Dễ sử dụng (chỉ cần một loại thuốc thử).
- Độ nhạy cao (có thể phát hiện protein ở 1 - 20µg).
- Phức chất giữa thuốc nhuộm và protein tương đối ổn định.
- Phương pháp này ít bị cản trở bởi các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu protein.
*Nguyên tắc
Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thụ cực đại và sự thay đổi màu xảy ra khi Coomasie Brilliant Blue liên kết với protein trong dung dịch acid. Trong dung dịch mạnh tính acid, khi không kết nối với protein thì thuốc nhuộm có bước sóng cực đại ở 465nm. Khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thu bước sóng cực đại ở 595nm. Nhờ đó mà xác đinh được nồng độ protein. Dạng proton hóa của thuốc nhuộm Coomasie Brilliant Blue có màu xanh. Thuốc nhuộm liên kết chặt chẽ với các protein, tương tác với tất cả các nhóm kỵ nước và các nhóm mang điện tích dương trên phân tử protein. Trong môi trường của gốc mang điện tích dương, sự proton hóa không xảy ra và màu xanh xuất hiện. Màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và ổn định trong gần 1 giờ.
*Chuẩn bị hóa chất:
- Dung dịch albumin chuẩn (0,1mg/ml): cân chính xác 10mg albumin, thêm 50ml nước cất khuấy tan albumin. Cho toàn bộ dung dịch trên vào bình định mức 10ml dẫn nước tới vạch ―> dung dịch albumin chuẩn có nồng độ 0,1mg/ml. Giữ ở - 20ºC.
- Dung dịch thuốc thử Bradford có thành phần trong 100ml như sau: + Coomasie Brilliant Blue (CBB): 0,001g
+ Ethnol tuyệt đối: 4,7g + Acid phophoric 85%: 8,5g
Phẩm màu CBB được làm tan trong ethanol trong một chai đựng màu tối có nắp. Bổ sung acid phosphoric và chỉnh tới 100ml bằng nước cất. Lắc đều, bảo quản ở 4ºC.
Bảng 1. Bảng số liệu dựng đường chuẩn Albumin. Ống nghiệm Đối chứng 1 2 3 4 5 6 7 8 Nồng độ albumin(mg/ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 Dung dịch albumin(µl) 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Nước cất(µl) 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 - Sau đó hút 30µl enzyme đã pha theo từng nồng độ ở trên cho vào những ống nghiệm mới. Sau đó bổ sung 1470µl thuốc thử Bradford (theo tỷ lệ 1:49).
Lắc đều các ống nghiệm, tiến hành đo OD dung dịch trong các ống nghiệm bằng máy đo quang phổ UV.
Trị số mật độ quang phổ (OD) của các ống từ 1 đến 10 sau khi trừ đi trị số của ống đối chứng sẽ dựng được đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang phổ (∆OD) theo nồng độ protein chuẩn (mg/ml).
Kết quả của quá trình đo OD được thể hiện ở bảng phụ lục 2.
Bảng 2. Giá trị OD theo nồng độ Albumin.
Nồng độ Albumin
(mg/ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8
Mật độ quang (OD) 0,17 0,23 0,28 0,34 0,4 0,45 0,52 0,55
*Xác định nồng độ protein của mẫu
Dịch chiết enzyme thô của dịch nhựa vả được tiến hành như trên. Thay dung dịch albumin bằng mẫu enzyme cần định lượng, mẫu được pha sao cho trị số mật độ quang đo được nằm trong khoảng của đường chuẩn.
Tương tự như vậy, trị số mật độ quang của mẫu thí nghiệm cũng trừ đi trị số mật độ quang của ống đối chứng, rồi chiếu vào đường chuẩn để suy ra lượng protein có trong dung dịch mẫu thí nghiệm (mg/ml).
*Tính kết quả
Tổng hàm lượng protein trong V (ml) chế phẩm thô được tính theo công thức:
Với:
b: nồng độ protein trong mẫu suy ra từ đường chuẩn (mg/ml). m: hệ số pha loãng.
V: thể tích dung dịch chế phẩm enzyme thô (ml).
1.2. Phương pháp xác định hoạt tính protease.
+ Về nguyên tắc protease xúc tác cho các phản ứng thủy phân peptid R – CH – C – NH – CH – R’ + H2O -> RCH – C – OH + H2N – CHR’ NH2 O COOH NH2 O COOH
Các enzyme thuộc nhóm này có tính chuyên hóa cao đối với vị trí của liên kết peptid, bản chất của các acid amin tham gia trong liên kết peptid cũng như các acid amin ở lân cận liên kết peptid. Ngoài liên kết peptid protease còn có thể xúc tác các phản ứng thủy phân liên kết este, liên kết amin và phản ứng chuyển vị gốc acid amin. Vì vậy, để xác định hoạt độ nhiều protease có thể dùng nhiều loại cơ chất khác nhau. Các protein, các peptid tự nhiên hay tổng hợp, các este và amid của acid amin, tùy theo từng loại enzyme cần chọn cơ chất thích hợp và điều kiện thích hợp để xác định hoạt độ của nó. Ở đây chúng tôi chọn cơ chất cho phản ứng mà protease xúc tác là casein, với nồng độ là 1% [2].
+ Xác định hoạt độ của protease theo phương pháp Amano [2], [8]
-Nguyên tắc: protein (casein) làm cơ chất. Xác định độ hoạt động phân giải protein của enzyme trên cơ sở xác định lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng, bằng phản ứng màu với thuốc thử folin – clocalteau. Dựa vào đồ thị đường chuẩn, định lượng tyrosin tương ứng với lượng sản phẩm thủy phân dưới tác dụng của enzyme.
Đơn vị hoạt động của proteolitic (casein) là lượng enzyme mà trong 1 giờ ở 30ºC có khả năng phân giải protein tạo các sản phẩm hòa tan trong acid trichloroacetic, cho phản ứng màu với thuốc thử folin – clocalteau. Dựa vào đồ thị đường chuẩn, định lượng tyrosin tương ứng với 1µg tyrosin. Hoạt động riêng của các chế phẩm được biểu diễn bằng số đơn vị hoạt động proteolitic trên 1ml protein chế phẩm.
- Chuẩn bị hóa chất:
+ Dung dịch cơ chất casein 1%.
Cân 1g casein hòa tan trong 100ml dung dịch đệm phosphat 0,1M có pH = 7, đun trên bếp điện cho đến lúc hòa tan hoàn toàn.
+ Dung dịch folin – clocalteau (0,1N)
Hút 1ml dung dịch folin – clocalteau 1N hòa tan trong 9ml nước cất để được dung dịch folin 0,1N.
+ Dung dịch Na2CO3 0,4M:
+ Dung dịch acid trichloroacetic 0,4M:
- Cách tiến hành: chuẩn bị 2 ống nghiệm sạch, ống thí nghiệm và ống trắng + Ống thí nghiệm: cho 0,2ml cơ chất đã đạt đến 35ºC vào ống nghiệm giữ 5 – 10 phút ở nhiệt độ 35ºC, cho 0,2ml dung dịch enzyme (đã đạt được nhiệt độ 35ºC) tiếp
tục giữ ở 35ºC trong vòng 10 phút, cho ngay 0.4ml dung dịch acid trichloroacetic (TCA), lắc đều trong 30 phút ở khoảng nhiệt độ trên, đem đi ly tâm để loại tủa. Sau khi ly tâm lấy 0,2ml dịch nổi cho vào ống nghiệm khác để làm phản ứng màu với thuốc thử folin – clocateau.
Xác định mật độ quang của dung dịch. Thêm 0,2ml dịch sau khi ly tâm vào 1ml dung dịch Na2CO3 6% lắc đều.Thêm 0,2ml thuốc thử folin 0,1N, lắc đều và giữ 30 phút ở nhiệt độ phòng rồi tiến hành so màu trên máy speckol với bước sóng 660 nm. Dùng cuvet thủy tinh.
+ Ống trắng: cho vào ống nghiệm 0,2ml cơ chất rồi cho 0,2ml HCl vào, thêm tiếp 0,4ml TCA (acid trichloroacetic) lắc đều và giữ 30 phút ở nhiệt độ 35ºC, tiến hành ly tâm và các bước tiếp theo tương tự như đối với ống thí nghiệm.
- Xây dựng đồ thị chuẩn tyrosin: Dung dịch tiêu chuẩn tyrosin (mg/ml)
Cân chính xác 1mg tyrosin tinh khiết khô hòa tan trong một ít dung dịch
HCl 0,2N, cho vào bình định mức 1ml và cho HCl 0,2N đến vạch định mức. Từ dung dịch này pha loãng tiếp tục bằng HCl 0,2N để nhận được dung dịch có chứa 10µg/ml