3. Ý nghĩa khoa học và thực tiển của luận văn
2.3.1. Phương pháp tách chế phẩm ficin từ nhựa vả
2.3.1.1. Quy trình tách nhựa từ quả vả
Hình 2.3. Sơ đồ quy trình thu nhận dịch nhựa từ quả vả [9], [10]
* Thuyết minh quy trình:
Dịch nhựa được thu nhận khi quả vả vừa mới thu hoạch vào buổi sáng sớm. Dùng bình tam giác đặt trong xô đá để hứng lấy dịch nhựa chảy ra từ cuống quả vả. Tiếp tục cắt thêm một đoạn khoảng 0,5 – 1cm trên cuống quả để tận thu dịch nhựa. Lưu ý, trong quá trình cắt cuống không được cắt thâm vào thịt quả quá 2cm [10]. Ngoài ra, tránh nhiễm bụi, tạp chất, kim loại, tránh ánh sáng và luôn giữ ở điều kiện lạnh để tránh ảnh hưởng đến hoạt độ của enzyme trong quá trình thu nhận. Sau đó, dịch nhựa từ quả vả (gọi là nhựa vả) nhanh chóng đem về phòng thí nghiệm bảo quản ở nhiệt độ < 5ºC.
Cây vả
Trái vả còn cuống
Cắt cuống
Lấy nhựa giữa cuống và quả (điều kiện lạnh)
2.3.1.2. Quy trình tách enzyme ficin từ nhựa quả vả.
Hình 2.4. Quy trình thu nhận chế phẩm enzyme ficin từ nhựa quả vả [9], [10], [25]
Quả vả
Khấy từ (100 vòng/phút, 5
phút)
Ly tâm thu tủa (10000 vòng/phút,
4oC10phút) Dịch nổi Lấy nhựa (điều kiện lạnh)
Hòa tan trong nước cất Ly tâm (4000 vòng/phút, 4oC) Bảo quản enzyme Kết tủa protein Chế phẩm enzyme Dung môi Nước cất Tạp chất cặn bẩn Dung môi
* Thuyết minh quy trình:
Dịch nhựa thu được bảo quản ở nhiệt độ đông (-20ºC) sau đó ta đem xuống ngăn lạnh trước khi tiến hành thu nhận enzyme ficin. Tiến hành hòa tan dịch nhựa với nước cất bằng cách cân 5g dịch nhựa hòa với nước cất tỉ lệ 1/2 [5]. Sử dụng máy khuấy từ (100 vòng/phút), trong thời gian 2 – 3 phút để tạo điều kiện cho quá trình hòa tan được triệt để. Tiếp theo, dung dịch được tách tạp chất và các phần không tan bằng máy ly tâm lạnh (4000 vòng/phút, trong 10 phút). Sau khi ly tâm ta loại bỏ lớp cặn dưới đáy và một phần dịch trắng đục nổi lên trên bề mặt, chỉ thu phần dịch ở giữa để tiến hành kết tủa protein. Tại giai đoạn kết tủa bằng dung môi hữa cơ ta tiến hành khảo sát các loại dung môi (ethanol, aceton) cần tủa, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (1/1, 1/2, 1/3, 1/4 và 1/5), thời gian (30 phút, 60 phút và 90 phút), nhiệt độ (1ºC, 3ºC và 5ºC) kết tủa. Dựa vào phương pháp loại suy chúng tôi sẽ lựa chọn các thông số thích hợp cho quá trình kết tủa protein có trong dịch nhựa. Để thu nhận tủa protein chúng tôi tiến hành ly tâm lạnh (10000 vòng/phút, 10 phút, 4oC). Sau khi ly tâm lượng kết tủa sẽ lắng xuống dưới và được tách bằng cách lọc hoặc hút. Sau đó, làm khô tủa từ 2 giờ – 3 giờ trong điều kiện lạnh. Kết tủa thu được đem đi hòa trong dung dịch đệm phosphat để tiến hành đo hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford và hoạt độ protease bằng phương pháp Amano.