3. Ý nghĩa khoa học và thực tiển của luận văn
3.6. KHẢO SÁT MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA CHẾ PHẨM FICIN TỪ NHỰA
hàm lượng 2,212 (mg/ml) khi tỷ lệ dịch nhựa/ethanol 96% là 1/4, thời gian kết tủa 60 phút và nhiệt độ kết tủa ở 3ºC. Để có thể ứng dụng chế phẩm enzyme ficin (tách từ dịch nhựa quả vả) trong công nghệ thực phẩm chúng tôi cần phải khảo sát một số tính chất cơ bản để theo dõi hoạt độ của enzyme ficin này. Trong phần nghiên cứu tiếp theo chúng tôi khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ hoạt động, pH và độ bền nhiệt của chế phẩm ficin này.
3.6. KHẢO SÁT MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA CHẾ PHẨM FICIN TỪ NHỰA QUẢ VẢ QUẢ VẢ
3.6.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của chế phẩm ficin
Nhiệt độ là yếu tố mạnh ảnh hưởng đến hoạt độ protease của nhựa vả. Khi nhiệt độ tăng, hoạt độ protease tăng nhưng chỉ đến một mức nào đó, nếu tiếp tục tăng thì hoạt độ của enzyme sẽ giảm vì nhiệt độ quả cao sẽ làm biến tính protein gây bất hoạt enzyme. Nhiệt độ mà ở đó enzyme hoạt động mạnh nhất gọi là nhiệt độ tối ưu. Mỗi enzyme có một nhiệt độ hoạt động tối ưu khác nhau [32].
Để khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của chế phẩm ficin thu nhận từ dịch nhựa quả vả, chúng tôi theo dõi ở các mức nhiệt độ: 35ºC, 40ºC, 45ºC, 50ºC, 55ºC và 60ºC với cơ chất casein, pH = 7. Kết quả thu nhận được theo phương pháp Amano được thể hiện ở hình 3.6.
Hình 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ chế phẩm ficin
Chú thích: các chữ cái a, b, c, d, e thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa thống kê
Theo kết quả ở hình 3.6 cho thấy, các giá trị nhiệt độ khác nhau enzyme thể hiện hoạt độ xúc tác khác nhau. Khi tăng nhiệt độ từ 35ºC đến 45ºC, hoạt độ enzyme tăng dần
0,786c 0,81b 0,835a 0,808b 0,721d 0,612e 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 35 40 45 50 55 60 H oạt độ p rot eas e (H p/m l) Nhiệt độ (°C)
theo nhiệt độ. Nhưng khi nhiệt độ tiếp tục tăng hoạt độ của chế phẩm enzyme này không tăng thêm mà bắt đầu có xu hướng giảm, gây nên hiện tượng biến tính nhiệt ở enzyme. Từ các số liệu nhận được cho thấy, 45ºC là nhiệt độ thích hợp cho phản ứng của chế phẩm ficin và cho giá trị hoạt độ protease cao nhất 0,835(Hp/ml). Kết quả này phù hợp với số liệu được tác giả Nguyễn Đức Lượng công bố năm 2004, nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính xúc tác của ficin nằm trong khoảng 40-65oC, tùy thuộc vào từng loại vả.
3.6.2. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của chế phẩm ficin
pH có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt độ enzyme. Mỗi enzyme hoạt động mạnh ở một pH nhất định khác nhau. Để khảo sát ảnh hưởng pH đến hoạt độ protease của nhựa quả vả, kết tủa protease được hòa tan trong các pH của dung dịch đệm khác nhau (pH = 5, 6, 7, 8 và 9). Sau đó cho enzyme tác dụng với cơ chất casein nhiệt độ phản ứng là 30ºC, thời gian phản ứng là 30 phút. Tiếp theo, ly tâm lấy dịch trong và xác định hoạt độ protease theo phương pháp Amano để xác định ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của chế phẩm enzyme ficin. Kết quả nhận được thể hiện ở hình 3.7.
Hình 3.7. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ chế phẩm ficin
Chú thích: các chữ cái a, b, c, d thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa thống kê
Qua hình 3.7 thấy rằng, khi thay đổi pH, hoạt độ của enzyme cũng thay đổi theo. Khi pH tăng từ 5 đến 6, hoạt độ của chế phẩm cũng tăng dần nhưng nếu tiếp tục tăng pH lên 7, 8 và 9, hoạt độ của chế phẩm lại giảm. Ở pH = 6 cho giá trị hoạt độ trung bình của ba lần lặp là cao nhất 0,974 (Hp/ml). Từ kết quả thể hiện ở trên, chúng tôi chọn giá trị pH = 6 là pH thích hợp cho hoạt động của chế phẩm enzyme ficin.
3.6.3. Khảo sát độ bền nhiệt của chế phẩm ficin
Tính bền nhiệt rất quan trọng cho việc ứng dụng enzyme trong công nghiệp. Để nghiên cứu tính bền nhiệt của protease từ nhựa vả. Chế phẩm ficin sẽ được ủ ở các
0,861c 0,974a 0,923b 0,842c 0,563d 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 5 6 7 8 9 H oạt độ p rot eas e (H p/m l) pH
Kết quả nghiên cứu được thể hiện ở hình 3.8.
Hình 3.8. Khả năng bền nhiệt của chế phẩm ficin
Chú thích: các chữ cái a, b, c, d, e thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa thống kê
Theo kết quả được biểu diễn ở hình 3.8 thấy rằng, chế phẩm ficin bền ở khoảng nhiệt độ từ 35ºC đến 50ºC sau thời gian ủ là 60 phút. Thậm chí đến 50ºC, hoạt độ protease vẫn còn trên 90% so với ban đầu. Từ 55ºC trở đi, hoạt độ protease bắt đầu giảm mạnh. Điều này chứng tỏ protease kém bền ở nhiệt độ cao. Nhiệt độ càng cao thì protease bị bất hoạt càng lớn, dẫn đến hoạt độ của chế phẩm giảm sau 55ºC. Từ kết quả đạt được, chúng tôi chọn độ bền nhiệt của chế phẩm ficin từ 35-500C.
3.7. KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LÀM MỀM THỊT BÒ 3.7.1. Khảo sát độ dai của thịt 3.7.1. Khảo sát độ dai của thịt
Sau 2 giờ giết mổ, mẫu thịt được phân tích độ dai theo các mức thời gian ướp khác nhau (0, 5, 10, 15 và 20 phút). Kết quả thể hiện ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của chế phẩm ficin đến độ dai của thịt bò
Độ dai của thịt
(N)
Mẫu Thời gian ướp thịt (phút)
0 5 10 15 20 Trước luộc ĐC 17,77a Có bổ sung chế phẩm 17,82a 19,60a 19,90a 19,50a 22,13ab Sau luộc ĐC 54,33c Có bổ sung chế phẩm 54,60c 52,60b 52,03b 50,33a 50,60a
* ĐC : đối chứng, thịt không bổ sung chế phẩm
0,949a 0,939a 0,908ab 0,883b 0,63d 0,497e 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 35 40 45 50 55 60 H oạt độ p rot eas e (H p/m l) Nhiệt độ (°C)
Ghi chú: Các chữ cái a, b, c, thể hiện sự sai khác có nghĩa thống kê theo hàng của bảng biểu đối với hàm mục tiêu thịt trước và sau luộc.
Qua bảng số liệu cho thấy, độ dai của thịt sau khi chế biến có thay đổi sau khi bổ sung chế phẩm ficin, (54,33 N và 50,60 N tương ứng với mẫu đối chứng và mẫu nghiên cứu sau 20 phút ướp thịt). Qua đó, mẫu có bổ sung chế phẩm sẽ mềm thịt hơn so với đối chứng. Tuy nhiên, giữa thời gian 15 và 20 phút ướp thịt, độ dai của thịt thay đổi không đáng kể. Sự thay đổi độ dai của thịt khi có bổ sung chế phẩm ficin có thể được giải thích, enzyme ficin phân giải các cơ thịt nên đã làm cho thịt mềm hơn.
3.7.2. Khảo sát tỷ lệ mất nước của thịt
Các thí nghiệm được bố trí tương tự như xác định độ dai của thịt, kết quả được thể hiện ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của chế phẩm ficin đến tỷ lệ mất nước của thịt bò
Tỷ lệ mất nước (%)
Thời gian ướp thịt (phút)
0 5 10 15 20
ĐC 22,64a 24,60b 24,90b 25,37bc 25,13b
Có bổ sung chế phẩm 22,64c 24,75d 19,13b 18,70ab 17,33a
* ĐC : đối chứng, thịt không bổ sung chế phẩm
Ghi chú: Các chữ cái a, b, c, d thể hiện sự sai khác có nghĩa thống kê theo hàng của bảng biểu đối với tỷ lệ mất nước của thịt khi không hoặc có bổ sung chế phẩm ficin.
Qua bảng số liệu cho thấy tỷ lệ mất nước của thịt tăng theo thời gian đối với mẫu đối chứng từ 22,64% đến 25,13% sau 20 phút trong điều kiện phòng thí nghiệm. Trong khi đó, mẫu có bổ sung chế phẩm ficin phần nào hạn chế tỷ lệ mất nước của thịt, sau 20 phút tỷ lệ giảm còn 17,33%. Điều này có thể giải thích, chế phẩm ficin đã xúc tác làm đứt các mạch polypeptit dài tạo thành các mạch ngắn hơn, tạo điều kiện liên kết với các phân tử nước nhiều hơn. Ngoài ra, chế phẩm ficin có khả năng phá vỡ cấu trúc mô protein liên kết thông qua đó bổ sung phân tử nước, do đó có thể làm cho tỷ lệ nước trong thịt giảm đi không đáng kể.
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. KẾT LUẬN
Qua quá trình nghiên cứu, chúng tôi đưa ra một số kết luận ở quy mô phòng thí nghiệm như sau:
- Xây dựng được đường chuẩn albumin và tyrosin cho việc xác định hàm lượng protein và hoạt độ protease phục vụ cho mục đích của đề tài nghiên cứu.
- Hàm lượng protein đạt 2,122 (mg/ml) và hoạt độ protease đạt 1,015 (Hp/ml) khi các thông số kỹ thuật ảnh hưởng đến quá trình thu nhận được lựa chọn như sau:
+ Đã khảo sát được sự có mặt của protein trong dịch nhựa của 3 giai đoạn thu hoạch khác nhau của quả vả nghiên cứu: quả non, quả thu hoạch, quả già chín. Và nhận thấy dịch nhựa từ quả vả thu hoạch chứa nhiều enzyme protease nhất.
+ Chọn được ethanol 96% là dung môi hữu cơ sử dụng để kết tủa protein thích hợp và tỷ lệ dịch nhựa/ethanol 96% là 1/4.
+ Khảo sát được nhiệt độ kết tủa protein thích hợp là 3ºC và thời gian kết tủa trong 60 phút.
- Khảo sát được một số tính chất của chế phẩm ficin: Nhiệt độ thích hợp ở 45ºC, pH = 6 và độ bền nhiệt của chế phẩm ficin nằm trong khoảng từ 35ºC - 50ºC trong thời gian 60 phút.
- Bước đầu khảo sát khả năng làm mềm thịt của chế phẩm ficin (độ dai của thịt bò đạt 50,60 N và tỷ lệ mất nước giảm còn 17,33% sau 20 phút).
5.2. KIẾN NGHỊ
Các kết quả nghiên cứu trên đây chỉ mới là những nghiên cứu bước đầu của quá trình thu nhận chế phẩm protease và khảo sát một số tính chất của enzyme protease ở đối tượng nghiên cứu là nhựa của quả vả. Do vậy, chúng tôi có một vài kiến nghị về hướng phát triển của đề tài như sau:
- Tối ưu hóa các điều kiện thiết lập nên một quy trình protease từ nhựa vả thật hoàn chỉnh.
- Tiếp tục xây dựng quy trình tinh chế enzyme ficin trong nhựa quả vả, đi sâu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình tách và tinh chế enzyme, đồng thời kiểm tra hoạt độ enzyme sau khi tinh chế.
- Nghiên cứu sâu hơn việc ứng dụng enzyme ficin vào ngành công nghiệp làm mềm thịt nói riêng và vào công nghệ thưc phẩm nói chung.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt
[1]. Hoàng Kim Anh, Trần Ngọc Hiếu, 2011, Ứng dụng enzyme trong công nghệ thực phẩm, NXB Khoa học - Kỹ thuật.
[2]. Nguyễn Trọng Cẩn (chủ biên), Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến, 1998, Công nghệ enzyme, NXB Nông nghiệp – TP. Hồ Chí Minh.
[3]. Nguyễn Hữu Chấn, 1996, Enzyme và xúc tác sinh học, NXB y học.
[4]. Phạm Thị Trân Châu, Trịnh Hồng Thái (1995). Tinh sạch và nghiên cứu một số tính chất của proteinase ở sâu xanh, Heliothis armigera. Tạp chí khoa học Đại Học Quốc gia Hà Nội, 6(1), tr. 42-50.
[5]. Lê Nguyễn Đoan Duy, Huỳnh Thị Phương Thảo, Nguyễn Công Hà, 2014,
Khảo sát quá trình sinh tổng hợp protease từ Aspergillus oryzae trên môi trường bán rắn, Tạp chí khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 33, 104 – 109.
[6]. Quách Đĩnh, Nguyễn Văn Tiếp, Nguyễn Văn Thoa, 1996, Công nghệ sau thu hoạch và chế biến rau quả, NXB Khoa học - Kỹ thuật.
[7]. Nguyễn Lệ Hà, 2015, Protease tinh sạch từ tôm sú Penaeus monodon và một số tính chất cơ bản, Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản.
[8]. Trần Quốc Hiền, Lê Văn Việt Mẫn, 2016, Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme protease từ ruột cá Basa (Pangasius bocourti), Tạp chí phát triển KH & CN, tập 9, số 11.
[9]. Lê Gia Hy, Lỗ Tiến Sỹ, Phạm Kim Dung, Trương Nam Hải (1999), . Nghiên cứu lên men sản xuất proteinase kiềm từ chủng xạ khuẩn ưa kiềm CD 2-1 phân lập ở Việt Nam. Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 2000, 3, tr. 12-16.
[10]. Nguyễn Đức Lượng (chủ biên), Cao Cường, Nguyễn Ánh Tuyết, Lê Thị Thủy Tiên, Huỳnh Ngọc Oanh, Nguyễn Thúy Hương, Phan Thị Huyền, Tạ Thu Hằng, 2012, Công nghệ enzyme, NXB Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.
[11]. Nguyễn Văn Mùi, 2001, Thực hành hóa sinh, NXB Quốc gia Hà Nội.
TPHCM.
[13]. Quyền Đình Thi, Trần Thị Quỳnh Anh, 2007, Một số tính chất của protease ngoại bào chủng vi sinh vật biến Acinetobacter SP. QN6, Tạp chí Công nghệ sinh học 5 (2): 197:203.
[14]. Đỗ Thị Bích Thủy, 2011, Hóa sinh thực phẩm, NXB Đại học Huế.
[15]. Đỗ Thị Bích Thủy, 2006, Nghiên cứu thu nhận chế phẩm protease từ một số nguồn khác nhau và ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, Nhà xuất bản Đại học Đà Nẵng
[16]. Lê Ngọc Tú, La Văn Chư, Phạm Trân Châu, Nguyễn Văn Dũng, 1982,
Enzyme vi sinh vật, NXB Khoa học - Kỹ thuật.
[17]. Lê Ngọc Tú, 2010, Hóa sinh công nghiệp, NXB Khoa học - Kỹ thuật.
[18]. Nguyễn Thị Cẩm Vi, 2011, Khảo sát sự biến đổi hàm lượng protein hòa tan và hoạt tính bromelain trong quá trính phát triển của quả dứa, Tạp chí Khoa học - Ứng dụng.
Tài liệu tiếng Anh
[19]. Bouton P.E., Harris P.V., Shorthose W.R., 2001. Effec of ultimate pH upon the water-holding capacity and tenderness of mutton. Journal of food science 36, 435-439
[20]. Bradford MM, 1976, A rapid and sensitive mocrogram quantities of protein utilizing the priciple of protein dye biding, Anal. Biochem, 72: 248 – 254.
[21]. Danielle Baeyens-Volant, Andre Matagne, Rachida El Mahyaoui, Ruddy Wattiez, 2015, A novel form of ficin from Ficus carica latex: Purification and characterization, Phytochemistry 117 (2015) 154–167.
[22]. Devaraj, K.B., Kumar, P.R., Prakash, V., 2008, Purification, characterization and solvent-induced thermal stabilization of ficin from Ficus carica, J. Agric. Food Chem. 56, 11417–11423.
[23].
[24].
Hamid Zare, Ali Akbar Moosavi-Movahedi, Maryam Salami, Morteza Mirzaei, Ali Akbar Saboury, Nader Sheibani, 2012, Purification and autolysis of the ficin isoforms from fig (Ficus carica cv. Sabz) latex, Phytochemistry.
Honikel K.O., 1998. Reference methods for the Assessment of Physical Characteristics of Meat. Meat science 49 (4), 447-457
[25]. Mohammed Gagaoua et al, 2014, Three-phase partitioning as an efficient method for the purification and recovery of ficin from Mediterranean fig (Ficus carica L.) latex.
[26]. Nison Sattayasai (2012), Protein Purification, Khon Kaen University Thailand.
[27]. Jones, I.K., Glazer, A., 1970. Comparative studies on four sulfhydryl endopeptidases (‘‘ficins’’) of Ficus glabrata latex. J. Biol. Chem. 245, 2765–2772.
[28]. Kramer, D.E., Whitaker, J.R., 1964. Ficus enzymes II, Properties of the proteolytic enzymes from the latex of Ficus carica variety kodata. J. Biol. Chem. 239, 2178– 2183.
[29]. Kramer, D.E., Whitaker, J.R., 1969, Nature of conversion ofFicus carica variety kadota ficin component D to component C. Some physicochemical properties of components C and D.Plant Physiol, 44, 1566–1573.
[30]. Singh, V.K., Patel, A.K., Moir, A.J., Jagannadham, M.V., 2008, Indicain, a dimeric serine protease from Morus indica cv. K2. Phytochemistry 69, 2110–2119.
[31]. Ramos, M.V., Araújo, E.S., Jucá, T.L., Monteiro-Moreira, A.C., Vasconcelos, I.M., Moreira, R.A., Viana, C.A., Beltramini, L.M., Pereira, D.A., Moreno, F.B., 2013, New insights into the complex mixture of latex cysteine peptidases in Calotropis procera. Int. J. Biol. Macromol. 58, 211– 219.
[32]. Torres, M.J., Trejo, S.A., Obregón, W.D., Avilés, F.X., López, L.M., Natalucci, C.L., 2012, Characterization of the proteolytic system present in Vasconcellea quercifolia latex. Planta 236, 1471–1484.
[33]. Turk, B., 2006. Targeting proteases: successes, failures and future prospects. Nat. Rev. Drug Discov. 5, 785–799. Vander Hoorn, R.A.L., 2008, Plant proteases: from phenotypes to molecular mechanisms, Annu. Rev. Plant Biol. 59, 191–223.
[34]. William MF, 1983, Microbial Enzyme and Biotechnology. Applied Science Publishers London and New York.
Tài liệu trang web [35]. http://blogtamsu.vn/cong-dung-chua-benh-cua-nhua-sung-it-nguoibiet.html. [36]. http://hoala.vn/product-detail/2847/cay- va.html. [37]. https://plus.google.com/102827822611566078241/posts/4KkfvqrAkc [38]. http://travahue.com/nguon-goc-trai-va/ [39]. [40]. https://vi.wikipedia.org/wiki/V%E1%BA%A3 http://www.vncreatures.net/chitiet.php?page=1&loai=2&ID=2533
PHỤ LỤC
PHỤ LỤC 1 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1.1. Phương pháp xác định hàm lượng protein [4], [17]
Bradford là một trong những phương pháp để xác định hàm lượng protein. Phương pháp này có một số ưu điểm như sau:
- Dễ sử dụng (chỉ cần một loại thuốc thử).
- Độ nhạy cao (có thể phát hiện protein ở 1 - 20µg).
- Phức chất giữa thuốc nhuộm và protein tương đối ổn định.
- Phương pháp này ít bị cản trở bởi các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu protein.
*Nguyên tắc
Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thụ cực đại và sự thay đổi màu xảy ra khi Coomasie Brilliant Blue liên kết với protein trong dung dịch acid.