3. Ý nghĩa khoa học và thực tiển của luận văn
2.3.5. Phương pháp cơ học
Sử dụng các biện pháp xử lý cắt cuốn để thu dịch nhựa từ quả. Phương pháp lọc, ly tâm để tách dịch nhựa.
2.3.6. Phương pháp xác định độ mềm thịt bò
2.3.6.1. Cách lấy mẫu
Mẫu thịt bò (longissimus dorsi) được lấy tại hai cơ sở giết mổ gia súc: tại Hương An, thị xã Hương Trà và tại Thủy Xuân, thành phố Huế. Sau 2 giờ giết thịt, mẫu được xử lý và phân tích độ dai và các chỉ tiêu liên quan như tỷ lệ mất nước và màu sắc của thịt bò. Các chỉ tiêu được theo dõi sau 0, 5, 10, 15 và 20 phút sau khi bổ sung chế
phẩm ficin và bên cạnh đó, mẫu đối chứng được tiến hành song song. Các chỉ tiêu phân tích được tiến hành tại phòng thí nghiệm của khoa Chăn nuôi - Thú y, trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế.
2.2.6.2. Xác định độ dai
Độ dai của thịt bò được xác định theo phương pháp của Honikel và cộng sự (1998). Đo độ dai tại 5 vị trí khác nhau trên mẫu (mẫu trước và sau luộc) phép đo được lặp lại 5 lần. Sử dụng máy đo độ dai WDS-1 với tốc độ lưỡi dao 300mm/phút.
Hình 2.5. Máy đo độ dai WDS-1 2.2.6.3. Xác định độ mất nước chế biến
Độ mất nước chế biến được xác định theo phương pháp Bouton và cộng sự (1971). Cân 10 g mẫu thịt (4 cm x 2 cm x 0,5 cm) và cho vào túi chịu nhiệt. Luộc trong thiết bị water bath (WNB10) ở 95oC trong 3 phút, sau đó làm mát dưới vòi nước chảy 5 phút. Lấy thịt ra khỏi túi, làm khô bằng khăn gạc mềm và cân khối lượng mẫu. Công thức tính tỷ lệ mất nước chế biến:
TL mất nước chế biến (%) =
m trước chế biến - m sau chế biến
100 m trước chế biến
2.3.7. Phương pháp toán học
Số liệu tính toán bằng bằng chương trình Microsoft Excel và đựơc xử lý bằng phần mềm Minitab 16.2.0.
2.3.8. Phương pháp bố trí thí nghiệm
2.3.8.1. Thí nghiệm 1
Nghiên cứu ảnh hưởng của độ già chín đến hàm lượng protein và hoạt độ protease của dịch nhựa quả vả.
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi mẫu thực hiện với 3 lần lặp. Các mẫu được thực hiện trong cùng điều kiện. Sau đó, xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford và hoạt độ protease theo phương pháp Amano để lựa chọn thời điểm thu hoạch dịch nhựa.
2.3.8.2. Thí nghiệm 2
Khảo sát lựa chọn dung môi (ethanol 96% và aceton) sử dụng để kết tủa protein trong dịch nhựa quả vả.
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi mẫu thực hiện với 3 lần lặp. Các mẫu được thực hiện trong cùng điều kiện.
Thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ hình 2 (mục 1.3.2, phụ lục 1).
2.3.8.3. Thí nghiệm 3
Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dịch nhựa/dung môi kết tủa đến hàm lượng protein và hoạt độ protease. Thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ hình 3 (mục 1.3.3, phụ lục 1).
2.3.8.4. Thí nghiệm 4
Khảo sát thời gian kết tủa ảnh hưởng đến hàm lượng protein và hoạt độ protease. Thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ hình 4 (mục 1.3.4, phụ lục 1).
Sau đó xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford và hoạt độ protease theo phương pháp Amano để lựa chọn thời gian kết tủa thích hợp để thu nhận chế phẩm protease từ dịch nhựa quả vả.
2.3.8.5. Thí nghiệm 5
Khảo sát nhiệt độ kết tủa ảnh hưởng đến hàm lượng protein và hoạt độ của protease.
Thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ hình 5 (mục 1.3.5, phụ lục 1).
Sau đó xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford và hoạt độ protease theo phương pháp Amano để lựa chọn nhiệt độ kết tủa thích hợp để thu nhận chế phẩm protease từ dịch nhựa quả vả.
2.3.8.6. Thí nghiệm 6
Khảo sát nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính của protease [25], [26]. Thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ hình 6 (mục 1.3.6, phụ lục 1).
Sau đó xác định hoạt độ protease theo phương pháp Amano để lựa chọn nhiệt độ thích hợp cho hoạt độ của chế phẩm protease từ dịch nhựa quả vả.
2.3.8.7. Thí nghiệm 7
Phương pháp tiến hành khảo sát pH thích hợp cho hoạt tính của protease [25], [26].
Thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ hình 7 (mục 1.3.7, phụ lục 1).
Sau đó xác định hoạt độ protease theo phương pháp Amano để lựa chọn pH thích hợp cho hoạt độ của chế phẩm protease từ dịch nhựa quả vả.
2.3.8.8. Thí nghiệm 8
Phương pháp tiến hành khảo sát độ bền nhiệt độ của enzyme protease [13]. Thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ hình 8 (mục 1.3.8, phụ lục 1).
Sau đó xác định hoạt độ protease theo phương pháp Amano để lựa chọn khoảng nhiệt độ cho độ bền của chế phẩm protease từ dịch nhựa quả vả.
2.3.8.9. Thí nghiệm 9
Phương pháp tiến hành khảo sát khả năng làm mềm thịt bò của chế phẩm ficin. Thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ hình 9 (mục 1.3.9, phụ lục 1)
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. HÀM LƯỢNG PROTEIN VÀ HOẠT ĐỘ PROTEASE Ở BA GIAI ĐOẠN THU HOẠCH KHÁC NHAU CỦA QUẢ VẢ THU HOẠCH KHÁC NHAU CỦA QUẢ VẢ
Quy trình tách protease và thuyết minh quy trình từ dịch nhựa của quả vả được trình bày ở phần phương pháp thí nghiệm. Mục đích của thí nghiệm này nhằm lựa chọn quả vả cung cấp dịch nhựa có chất lượng để thu nhận hoạt độ protease cao. Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành thu nhận dịch nhựa từ ba giai đoạn của quả vả: quả non, quả thu hoạch và quả già; sử dụng dung môi ethanol 96% để kết tủa protease và tỷ lệ dung môi cho vào trong quá trình kết tủa là 1/4 [8], [10].
Sau khi ly tâm thu kết tủa, chúng tôi sử dụng dung dịch đệm phosphate pH = 7 để hòa tủa, và xác định hàm lượng protein trong 3 mẫu theo phương pháp Bradford [18]. Ở mỗi mẫu chúng tôi tiến hành 3 lần lặp và kết quả giá trị hàm lượng protein sau khi làm phản ứng màu với thuốc thử Bradford Xtb. Giá trị hàm lượng được áp dụng công thức (CT1) để tính. Bên cạnh đó, để xác định hoạt độ protease trong các mẫu theo phương pháp Amano [18], với cơ chất sử dụng là casein. Ở mỗi mẫu chúng tôi tiến hành 3 lần lặp và kết quả giá trị hoạt độ protease sau khi làm phản ứng với casein và phản ứng màu với folin được giá trị Xtb. Giá trị hoạt độ được áp dụng công thức (CT2) để tính.
Kết quả xác định hàm lượng protein và hoạt độ protease theo ba mức độ chín khác nhau của quả vả được thể hiện ở hình 3.1.
Hình 3.1. Hàm lượng protein và hoạt độ protease theo độ chín của quả
Chú thích: các chữ cái a, b, c thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa thống kê trên
1,667c 1,903a 1,835b 0,726c 0,901a 0,815b 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2 Hoạt độ pr otease (Hp/m l) Hàm lượ ng pr otein (m g/m l)
từng dạng biểu đồ của đồ thị.
Kết quả trên đồ thị cho thấy hàm lượng protein và hoạt độ protease của dịch nhựa quả vả ở 3 giai đoạn thu hoạch khác nhau cho giá trị khác. Mẫu dịch nhựa ở quả vả có độ chín thu hoạch cho kết quả cao nhất, tương ứng 1,903 (mg/ml) và 0,901 (Hp/ml). Từ kết quả này cũng phản ánh hàm lượng protein và hoạt độ protease đều thay đổi theo độ già chín của quả vả. Điều này có thể giải thích, khi quả còn xanh non các thành phần dinh dưỡng trong quả chưa được tích lũy đầy đủ. Còn đối với quả vả quá chín, các hợp chất dinh dưỡng trong đó có thành phần protein sẽ chuyển hóa tạo thành các hợp chất axit hữu cơ nên đã ảnh hưởng đến việc thu nhận hàm lượng protein cũng như hoạt độ protease của chúng.
3.2. KHẢO SÁT DUNG MÔI KẾT TỦA
Có rất nhiều dung môi hữu cơ để kết tủa protease có nguồn gốc từ thực vật, tuy nhiên ở trong nghiên cứu này và dựa trên một số thí nghiệm khảo sát sơ bộ, chúng tôi sử dụng hai dung môi hữu cơ: ethanol 96% và aceton với mục đích để so sánh hiệu suất thu hồi protease và lựa chọn dung môi thích hợp. Quá trình tiến hành thí nghiệm như được mô tả ở phần bố trí thí nghiệm và chọn thời gian kết tủa 60 phút, trong điều kiện lạnh 5ºC và tỷ lệ dịch nhựa/dung môi là 1/4. Kết quả xác định hàm lượng protein và hoạt độ protease được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Hàm lượng protein và hoạt độ protease theo từng loại dung môi
Dung môi Hàm lượng protein (mg/ml) Hoạt độ protease (Hp/ml)
Ethanol 96% 1,914a 0,923a
Aceton 1,729b 0,724b
Chú thích: các chữ cái a, b, c thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa thống kê thể hiện theo từng cột trong bảng biểu.
Từ kết quả xác định hàm lượng protein và hoạt độ protease của dịch nhựa quả vả khi kết quả bằng ethanol 96% và aceton ở bảng 3.1 cho thấy ethanol 96% cho giá trị hàm lượng protein và hoạt độ protease cao nhất, tương ứng 1,914 (mg/ml) và 0,923 (Hp/ml). Kết quả này cũng cho thấy khả năng thu nhận protease phụ thuộc vào loại dung môi sử dụng để kết tủa, tùy thuộc vào tính chất và đặc điểm về cấu trúc mà mỗi loại thực vật mà loại dung môi sử dụng để kết tủa khác nhau.
Từ các kết quả bước đầu, chúng tôi tiếp tục khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng chính đến quá trình thu nhận chế phẩm ficin từ quả vả như: khảo sát tỷ lệ dịch nhựa/ethanol 96% (1/1, 1/2, 1/3, 1/4 và 1/5), khảo sát thời gian kết tủa protease (30, 60 và 90 phút) và khảo sát nhiệt độ kết tủa protease (1ºC, 3ºC và 5ºC). Thực hiện phương pháp loại suy để lựa chọn các thông số thích hợp cho việc thu nhận protease có hoạt độ cao.
3.3. KHẢO SÁT TỶ LỆ DỊCH NHỰA/ETHANOL
Để tiến hành khảo sát năm mốc tỷ lệ giữa dịch nhựa/ethanol 96% khác nhau: 1/1, 1/2, 1/3, 1/4 và 1/5 chúng tôi cố định thời gian kết tủa trong 60 phút và nhiệt độ kết tủa là 5ºC. Sau đó, ly tâm thu tủa và tiến hành đo hàm lượng protein và hoạt độ protease bằng thiết bị UV, kết quả nhận được thể hiện ở hình 3.2.
Hình 3.2. Hàm lượng protein và hoạt độ protease biến thiên theo tỷ lệ dịch
nhựa/ethanol 96%
Chú thích: các chữ cái a, b, c, d, e thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa thống kê trên từng dạng biểu đồ của đồ thị.
Theo các số liệu thực nghiệm ở hình 3.2 cho thấy, hàm lượng protein và hoạt độ protease có xu hướng tăng tỷ lệ thuận so với lượng ethanol sử dụng trên cùng một loại nguyên liệu. Cụ thể hàm lượng protein ở các mẫu 1/1, 1/2, 1/3, 1/4, 1/5 lần lượt là 1,002; 1,041; 1,209; 1,932 và 1,911 (mg/ml), và hoạt tính protease lần lượt là 0,303; 0,464; 0,720; 0,982 và 0,920 (Hp/ml). Kết quả cho thấy hàm lượng protein và hoạt độ protease tăng dần theo chiều tăng của lượng ethanol từ mẫu có tỷ lệ 1/1 đến mẫu có tỷ lệ 1/4 và đạt giá trị cực đại ở mẫu có tỷ lệ 1/4 lần lượt là 1,932 (mg/ml), 0,982 (Hp/ml), tương ứng. Sau đó, hàm lượng protein và hoạt độ protease không tăng nữa cho dù tăng lượng dung môi sử dụng.
Theo lý thuyết, khi tăng lượng dung môi, quá trình thu nhận protease sẽ trở nên nhiều hơn do khi phân tử dung môi tăng chúng sẽ tách triệt để hơn lớp phân tử nước bao lấy xung quanh phân tử protein, làm giảm tính tan của protein, tăng khả năng kết tủa của chúng. Tuy nhiên, khi chúng tôi tăng lượng ethanol 96% lên nhiều hơn so với tỷ lệ dịch dịch nhựa/ethanol = 1/4, hàm lượng protein không có sự sai khác về mặt thống kê còn hoạt độ protease ở tỷ lệ 1/5 có sự giảm nhẹ. Nên chúng tôi chọn tỷ lệ dịch nhựa/ethanol 96% là 1/4 để tiến hành các bước tiếp theo.
1,002c 1,041c 1,209b 1,932a 1,911a 0,303e 0,464d 0,720c 0,982a 0,92b 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 1/1 1/2 1/3 1/4 1/5 Hoạt độ pr otease (Hp/m l) Hàm lượ ng pr otein (m g/m l)
3.4. KHẢO SÁT THỜI GIAN KẾT TỦA PROTEASE
Sau khi chọn được tỉ lệ dịch nhựa/ethanol 96% là 1/4, chúng tôi tiếp tục khảo sát thời gian ở 3 mức: 30 phút, 60 phút và 90 phút; ở nhiệt độ 5ºC. Kết quả thu nhận được trình bày ở hình 3.3.
Hình 3.3. Hàm lượng protein và hoạt độ protease biến thiên theo thời gian
Chú thích: các chữ cái a, b, c thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa thống kê trên từng dạng biểu đồ của đồ thị.
Qua kết quả thể hiện trên hình 3.3, xét về mặt thời gian chúng tôi nhận thấy mẫu 1 (30 phút) tiến hành nhanh hơn mẫu 2 (60 phút) nên sẽ rút ngắn thời gian thí nghiệm, giá trị hàm lượng protein thu nhận được không sai khác có ý nghĩa theo mặt thống kê. Tuy nhiên, phân tích sâu về quá trình nghiên cứu và thu nhận kết quả chúng tôi thấy rằng biên độ kết quả của 3 lần lặp lại đối với mẫu 1 rất lớn (lần 1: 1,721 (mg/ml); lần 2: 2,194 (mg/ml) và lần 3: 1,891 (mg/ml)) trong khi đó biên độ kết quả của 3 lần lặp lại ở mẫu 2 ổn định hơn (lần 1: 1,895 (mg/ml); lần 2: 1,951 (mg/ml); lần 3 và 1,978 (mg/ml)), ngoài ra hoạt độ protease còn thể hiện giá trị hoạt độ cao nhất 0,987 (Hp/ml). Từ những lập luận trên chúng tôi chọn thời gian kết tủa protease là 60 phút để thực hiện các bước nghiên cứu tiếp theo.
3.5. KHẢO SÁT NHIỆT ĐỘ KẾT TỦA PROTEASE
Tiến hành tương tự chúng tôi khảo sát 3 mốc nhiệt độ là 1ºC, 3ºC và 5ºC, ở tỷ lệ dịch nhựa/ethanol 96% là 1/4, thời gian 60 phút. Kết quả khảo sát được thể hiện ở hình 3.4. 1,935a 1,941a 1,527b 0,925a 0,987a 0,785b 0,8 1 1,2 1,8 2,1 2,4 30 phút 60 phút 90 phút Hoạt độ pr otease (Hp/m l) Hàm lượ ng pr otein (m g/m l)
Hình 3.4. Hàm lượng protein và hoạt độ protease biến thiên theo nhiệt độ
Chú thích: các chữ cái a, b, c thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa thống kê trên từng dạng biểu đồ của đồ thị.
Qua kết quả khảo sát chúng tôi thấy rằng: khả năng kết tủa enzyme protease từ dịch nhựa quả vả phụ thuộc vào nhiệt độ. Khi tăng nhiệt độ từ 1ºC lên 3ºC, khả năng khuyếch tán cũng như kết tủa protease trong dịch nhựa có sự tăng nhẹ nhưng không thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa thống kê, hàm lượng protein tăng tương ứng từ 2,178 (mg/ml) lên 2,212 (mg/ml), nhưng hoạt độ protease của dịch nhựa quả vả tăng thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa thống kê từ 0,97 (Hp/ml) lên 1,015 (Hp/ml). Khi tăng nhiệt độ kết tủa lên 5ºC, hàm lượng protein và hoạt độ protease có xu hướng giảm đi chỉ còn 1,977 (mg/ml) và 0,948 (Hp/ml). Chứng tỏ rằng trong môi trường có dung môi hữu cơ (ethanol 96%), khi nhiệt độ càng cao khả năng biến tính protease càng lớn dẫn đến hoạt độ giảm.
Sau khi khảo sát các yếu tố ảnh hưởng (tỷ lệ dịch nhựa/ethanol 96%, thời gian và nhiệt độ kết tủa) đến quá trình thu nhận hàm lượng protein và hoạt độ protease, chúng tôi đề xuất quy trình thu nhận chế phẩm enzyme ficin từ dịch nhựa quả vả được trình bày như hình 3.5. Hoạt độ protease (Hp/ml) 2,212a 1,977b 0,97a 1,015a 0,948b 0,9 0,92 0,94 0,96 0,98 1 1,02 1,04 0 0,5 1 1,5 2 2,5 1°C 3°C 5°C Hàm lượng protein (mg/ml) Nhiệt độ 2,178 a
Hình 3.5. Quy trình thu nhận chế phẩm enzyme ficin từ dịch nhựa quả vả
Quả vả thu hoạch
Lấy dịch nhựa (Trong điều kiện lạnh
Hòa tan trong nước cất (tỷ lệ ½) Khuấy từ (100 vòng/ 5 phút, 4oC) Ly tâm (4000 vòng/ phút, 4oC, 10 phút) Kết tủa protease (3OC, 60 phút)
Ly tâm thu tủa (10000 vòng/ phút, 4oC 10 phút) Chế phẩm Enzyme ficin Ethanol 96% (Nhựa/Ethanol là ¼) Tạp chất cặn bẩn Dung môi
* Nhận xét: chế phẩm enzyme ficin thô được thu nhận từ dịch nhựa quả vả đạt hàm lượng 2,212 (mg/ml) khi tỷ lệ dịch nhựa/ethanol 96% là 1/4, thời gian kết tủa 60 phút và nhiệt độ kết tủa ở 3ºC. Để có thể ứng dụng chế phẩm enzyme ficin (tách từ dịch nhựa quả vả) trong công nghệ thực phẩm chúng tôi cần phải khảo sát một số tính chất cơ bản để theo dõi hoạt độ của enzyme ficin này. Trong phần nghiên cứu tiếp theo chúng tôi khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ hoạt động, pH và độ bền nhiệt của chế phẩm ficin này.