3. Ý nghĩa khoa học vă thực tiễn
2.3. PHƯƠNG PHÂP NGHIÍN CỨU
2.3.1. Sơ đồ nghiín cứu
Sơ đồ nghiín cứu
2.3.2. Bố trí thí nghiệm
Bảng 2.1. Phđn bố phiếu điều tra vă cơ cấu lấy mđ̃u
Địa điểm Tổng số hộ nuôi Số hộ tham gia nghiín cứu Số ao lấy mẫu Số mẫu kiểm tra
Huyện Quảng Ninh 205 30 9 24
TP Đồng Hới 120 20 9 24 Huyện Bố Trạch 437 30 8 22 Huyện Quảng Trạch 655 40 7 21 Tổng số 1.417 120 33 91 Đề xuất phòng vă trị Nuôi cấy, phđn lập
Thu mẫu tôm
Cố định vă bảo quản
2.4. VẬT LIỆU, PHƯƠNG TIỆN VĂ PHƯƠNG PHÂP 2.4.1. Dụng cụ vă mây móc 2.4.1. Dụng cụ vă mây móc
Micro pipet câc cỡ, đầu type nhựa câc cỡ dùng cho pipet, bộ nghiền mẫu, dao, kĩo, panh kẹp, đỉn cồn, bông tẩm cồn.... Tủ lạnh đm sđu, tủ lạnh thường, thiết bị chạy PCR
2.4.2. Vật liệu lăm thí nghiệm
Cồn 96º, soludin, Alkaline Peptone Water (APW), Lauria Broth (LB): Tryptone, NaCl, cao nấm men, Agar, nước cất vừa đủ. Mồi trường TCBS vă pha theo (Trần Linh Thước, 2008). Câc môi trường vă hóa chất để xâc định đặc tính sinh hóa của vi khuẩn: MR, VP, Nitrate broth (NB), Si mmon’s citrate agar, catalâe, Lecithinase Nitrate Citrate Maltose, O/F, maniol, câc loại đường. Thuốc thử: KOH, acid acetic,… Hóa chất nhuộm Gram: Crystal violet, lugo, cồn 96 %, safaranin hoặc fuchsin, vă một số hóa chất khâc. Môi trường vă hóa chất cho phản ứng PCR: bộ kit Wizard® SV Genomic DNA, Safe view TM, TBE 10X, EDTA, Lysis buffer, Absolute,…
2.4.3. Phương phâp thu mẫu
Mẫu được thu ngẫu nhiín từ cơ sở nuôi tôm của câc huyện khi có dấu hiệu nhiễm bệnh hoại tử gan tụy như chậm lớn, phđn đăn, dạt bờ, gan nhạt mău vă nhủn, mang sậm hoặc đen (Nguyễn Quang Linh vă ctv, 2012) [7].
Mẫu tôm nuôi được lấy theo phương phâp tổ hợp (ngẫu nhiín tại 6 vị trí ở câc ao) tại vùng nuôi. Mẫu được bảo quản trong chai sạch ngđm trong cồn với tỷ lệ 1/10 vă chuyển ngay về phòng thí nghiệm. Tại đđy mẫu được bảo quản ở 40C. Mẫu tôm bệnh vă tôm khỏe: được thu nguyín con với số lượng 91 mẫu.
Câc mẫu cần xâc định gen gửi đến cơ quan Thú y vùng IV vă vùng VIII để kiểm tra. Mẫu được thu ngẫu nhiín tại câc aonuôi có dấu hiệu bị bệnh họai tử gan tụy, dạt bờ, gan nhạt mău vă nhủn, mang sậm hoặc đen, cho văo túi ni lông có sục khí, đưa ngay đến phòng thí nghiệm để bảo quản, ghi nhên dân đầy đủ thông tin bín ngoăi. Sau đó tiến hănh lấy mẫu: cắt phần phụ, mang cho văo đĩa peptri, bảo quản vă đưa lín phòng vi sinh để tiến hănh nuôi cấy. Phương phâp nuôi cấy, phât hiện Vibrio parahaemolyticus trín môi trường thạch TCBS vă theo ISO/TS 21872 – 1: 15/04/2007. Âp dụng quy trình phđn lập đối với mẫu rắn nhỏ trín môi trường thạch CHROM Agar.
2.4.4. Phương phâp nuôi cấy vă định danh vi khuẩn
2.4.4.1. Nuôi cấy
Cđn 1g mẫu (khối gan tụy) văo cối sứ vô trùng, dùng chăy sứ nghiền mịn, bổ sung dần 9 ml canh thang tăng sinh alkaline pepton water (APW) để được độ pha loêng 10-1 rồi đổ văo ống nghiệm thủy tinh vô trùng (Nguyễn Lđn Dũng vă ctv, 1976). Ủ ở 370C trong 6 - 8 giờ (Trần Linh Thước, 2008). Mẫu sau khi đê ủ tăng sinh thì đem pha loêng thănh câc nồng độ 10-2 đến 10-5, lấy 0,1 ml mẫu từ câc nồng độ 10-3, 10-4,
10-5 cho văo môi trường nuôi cấy đê chuẩn bị trong câc đĩa peptri vô trùng vă dùng que tam giâc dăn đều lín bề mặt đĩa thạch. Mỗi nồng độ lặp lại 3 lần. Câc thao tâc pha loêng, đỗ đĩa thạch vă cấy mẫu được thực hiện trong buồng cấy vô trùng, sau đó để câc đĩa peptri đê cấy mẫu văo tủ ấm 370C trong 18 - 24 giờ (Trần Linh Thước, 2008) (Trích dẫn bởi Nguyễn Thị Bích Đăo vă ctv, 2015) [8].
2.4.4.2. Phđn lập vă tạo dòng thuần vi khuẩn
Sau khi nuôi cấy từ 24 - 48 giờ, tiến hănh quan sât câc đặc điểm về hình dạng, mău sắc, kích thước, bề mặt của khuẩn lạc để lựa chọn sơ bộ câc loăi thuộc chi Vibrio spp từ câc mẫu. Sau đó, câc khuẩn lạc có hình thâi đặc trưng, riíng biệt được cấy ria nhiều lần trín môi trường thạch đĩa để có khuẩn lạc thuần, cấy chuyền qua ống thạch nghiíng chứa môi trường TCBS vă giữ giống ở 40C.
2.4.4.3. Định danh vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
TCBS Agar được phât triển bởi Kobayashi vă cs, sau đó Nakanishin cải tiến thănh môi trường chọn lọc để phđn lđp Vibrio spp. Đđy lă môi trường có tính chọn lọc cao đối với Vibrio spp được chia lăm hai nhóm lớn: (1) Nhóm không có khả năng phđn giải đường sucrose sẽ sinh trưởng có khuẩn lạc mău xanh. (2) Nhóm có khả năng phđn giải, lín men đường sucrose sẽ lăm thay đổi pH của môi trường vă sinh trưởng có khuẩn lạc mău văng. Vì vậy, bín cạnh có khả năng mọc được trín môi trường chọn lọc TCBS với hình thâi khuẩn lạc điển hình, để xâc nhận câc chủng phđn lập được thuộc
Vibrio spp, sau đó tiến hănh nhuộm Gram [55].
Dựa văo quâ trình nhuộm Gram, câc phản ứng sinh hóa vă phđn tích định danh vi khuẩn. Thử câc phản ứng sinh hóa với vi khuẩn với câc đặc điểm như Bảng 2.1
Bảng 2.2. Đặc điểm câc phản ứng sinh hóa của
vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus [28]
Đặc điểm Vibrio
parahaemolyticus
Đặc điểm Vibrio
parahaemolyticus
Nhuộm Gram _ Orinithine
Decarboxylase + Di động + Sử dụng Citrate + Thử Oxydase + Urease _ Phât sâng + Khử NO3 NO2 + Phât triển ở 40 C _ Indol +
Đặc điểm Vibrio parahaemolyticus
Đặc điểm Vibrio
parahaemolyticus
Phât triển ở 370C + Sinh H2S _
Phât triển ở 0% NaCl _ Methyl red _
Phât triển ở 3% NaCl + Voges- Proskauer _
Phât triển ở 7% NaCl + Dịch hóa Gelatin +
Mẫn cảm 0/129 (10µl) S Axit hóa Arabinose D
Mẫn cảm 0/129 (150µl) S Axit hóa Glucose +
Phât triển trín TCBS Xanh Axit hóa Inositol _
Thử O/F Glucose +/+ Axit hóa Mannitol +
β galactosidase Axit hóa Salicin _
Arginine dihydrolase _ Axit hóa Sorbitol _
Lysine Decarboxylase + Axit hóa Sucrose _
Ghi chú: “+” : >90% câc chủng phản ứng dương “ _” : <90% câc chủng phản ứng đm. “d” : 11-89% câc chủng phản ứng dương.
“R”: không mẫn cảm
“S”: Mẫn cảm, chưa có số hiệu.
2.4.5. Quy trình PCR
T.W. Flegel vă câc nhă nghiín cứu đê có được thông tin so sânh về trình tự di truyền của vi khuẩn gđy bệnh EMS vă tiến hănh phương phâp phât hiện tâc nhđn gđy nín EMS bằng kỹ thuật PCR với quy trình như sau:
a) DNA từ dạ dăy, ruột hoặc mô gan tụy tôm, từ phđn của tôm bố mẹ hay tôm post, hoặc từ tôm post (nguyín con) hoặc cua còng, giâp xâc trong ao (vật lan truyền
hoặc có thể mang mầm bệnh) hoặc bùn đây ao,… Đối với mẫu vi khuẩn, chúng ta ly tđm 1ml dịch cấy, sau đó lấy nước nổi 2µl để cho văo PCR mix vă chạy PCR.
Đối với DNA phđn lập từ mô tôm bệnh chúng ta tâch chiết theo hướng dẫn, sau đó lấy 2µl để cho văo PCR mix vă chạy PCR.
Bảng 2.3. Chuẩn bị PCR mix: theo bảng dưới đđy
Tube PCR số 1 2 3 4 5 6
PCR mastermix 18µl 18µl 18µl 18µl 18µl 18µl
C[-] 2µl
Tâch chiết DNA M1 2µl
Tâch chiết DNA M2 2µl
Tâch chiết DNA M3 2µl
Tâch chiết DNA M4 2µl
NKAHPNSDNA C[+] 2µl
Bảng 2.4. Chương trình PCR
Chu kỳ Nhiệt độ Thời gian Mục đích
1 400C 10 phút Loại tr ừ ngoại nhiễm
1 950C 15 phút Kích hoạt hotstart taq polymerase
40 950C 20 giđy Biến tính
600C 30 giđy Bắt cặp
720C 01 phút Kĩo dăi
1 720C 10 phút Hoăn tất
b) Điện di:Sản phẩm khuếch đại PCR được chạy điện di trín gel agarose 2% (2 g garose/100 ml dung dịch đệm), sau đó nhuộm bằng dung dịch ethidium bromide, đọc kết quả dưới đỉn UV.
Bảng 2.5. Đọc kết quả
Mẫu 240bps 510bps 382bps 171bps Kết luận
C[-] - - - - Không ngoại nhiễm
C[+] + + + + Độnhạy PCRmix tốt
Mẫu + - - - VP [-], AHPNS [-]
Mẫu + + - - VP [+], AHPNS [-]
Mẫu + ++ ++ ++ VP [+], AHPNS [++]
Mẫu + + + + VP [+], AHPNS [+]
Ghi chú: VP: Vibrio parahaemolyticus; AHPNS: Hội chứng hoại tử gan tụy cấp do nhiễm Vibrio parahaemolyticus mang gín sinh độc tố.
2.4.6. Đọc kết quả vă xử lý số liệu
- Số liệu được được thu nhập vă xử lý sơ bộ trín phần mềm Excel vă xử lý thống kí bằng phần mềm SPSS 18.0. Câc giâ trị sai khâc có ý nghĩa thống kí khi p ≤ 0,05.
- Xâc định vi khuẩn Vibrio parahaemolyticusgđy bệnh tôm chết sớm bằng phđn lập vi khuẩn trín môi trường CHROM agar, TCBS nhằm nắm được đặc điểm sinh lý hình thâi của vi khuẩn năy.
- Xâc định GenVi khuẩn mọc trín hộp thạch phđn lập được gặt văo muối sinh lý vô khuẩn để đạt độ đục 0.5 – 1 McF. Sau đó đun câch thủy sôi trong 10 phút. Để nguôi rồi ly tđm 13.000RPM trong 5’. Lấy 5 ul dịch nổi cho văo PCR mix 45 l chứa sẵn câc thănh phần kể cả cặp mồi 16s – F vă 16s- R. khuếch đại đoạn DNA dăi 527 bps chứa trình tự đặc hiệu loại trín gene 16S của vi khuẩn. Chạy chương trình nhiệt PCR gồm 1 chu kỳ 95oC/5’ để kích hoạt Enzyme hot start Taq Polymerase rồi 40 chu kỳ 94oC/15’’ – 60oC/30’’- 72oC/1’. Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch bằng bộ “Wizard SV Gel and PCR clean – up Sytem” của Promega. Sản phẩm tinh sạch được điện di trín thạch vă sau đó định lượng bằng quang phổ GenQuant của Pharmacia, sau đó được đưa văo phản ứng giải trình tự 2 chiều sử dụng mồi xuôi vă mồi ngược của PCR thực hiện trín bộ thuốc thử “ DTCS cycle sequencing kit “ của Beckman coulter. Chương trình luđn nhiệt của phản ứng giải trình tự với bộ thuốc thử trín lă 30 chu kỳ 90oC/20’’ – 50oC/20’’- 60oC/4’. Sản phẩm của phản ứng giải trình tự được kết tủa bằng ethanol, rồi sau đó được chạy điện di giải trình tự trín mây giải trìn tự CEQ8000. Kết quả giải trình tự được so chuỗi bằn chương trình Blast search trín ngđn hăng dữ liệu gene cyar NCBI. Từ kết quả so chuỗi chúng ta sẽ có được kết quả định danh vi khuẩn.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÍN CỨU VĂ THẢO LUẬN
3.1. TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH VĂ TÍNH NGUY HẠI CỦA BỆNH EMS TRÍN TÔM THẺ CHĐN TRẮNG Ở QUẢNG BÌNH TÔM THẺ CHĐN TRẮNG Ở QUẢNG BÌNH
Diễn biến bệnh tôm chết sớm tại tỉnh Quảng Bình từ năm 2012 – 2014 qua bản đồ dịch tễ
Hình 3.1. Phđn bố câc ổ dịch EMS tại Quảng Bình theo không gian vă thời gian từ
năm 2012 – 2014
Hình 3.1 cho thấy, dịch bệnh EMS xuất hiện liín tục qua câc năm, những vùng đê bị bệnh thì khả năng xảy ra tiếp theo rất lớn vă tập trung chủ yếu thâng 5, 6. Điều năy có thể giải thích lă do vi khuẩn gđy bệnh EMS có thể tồn tại lđu ngăy trong bùn đây ao, nguồn nước, con giống vă trong tôm bệnh. Cho nín những ao đê bị bệnh EMS nếu cải tạo không kỹ trước khi nuôi rất dễ bị bệnh năy. Đồng thời, dịch bệnh thường xảy ra ở những vùng nuôi tập trung quy mô lớn, nguồn lấy nước văo từ kính cấp vă thoât chung cho cả vùng thím văo đó ý thức cộng đồng của người nuôi chưa tốt, nhiều hộ khi có dịch bệnh xảy ra, dấu dịch vă tự ý chữa trị đến lúc không có hiệu quả xả ra môi trường xung quanh, đđy lă nguy cơ lăm bệnh bùng phât vă lđy lan nhanh.
Bảng 3.1. Bệnh dịch EMS vă tình hình bệnh diễn biến qua câc năm 2012 - 4/2015
Huyện điều tra
Đê từng bị bệnh Đang bị bệnh trong
khi nghiín cứu
Tần số Tỷ lệ (%) Tần số Tỷ lệ (%)
TP Đồng Hới (n = 20) 4 20,0 5 25,0
Huyện Quảng Ninh (n = 30) 10 33,33 15 50,0
Huyện Quảng Trạch (n = 40) 13 32,50 17 42,5
Huyện Bố Trạch (n = 30) 13 43,33 15 50,0
Tổng cộng (n = 120) 40 33,33 52 43,33
Tình hình dịch bệnh tôm chết sớm ở 4 huyện thănh phố Quảng Bình từ năm 2012 đến nay lă khâ nghiím trọng, tình trạng bệnh ngăy căng tăng vă tỷ lệ cao hơn ở câc huyện so với thănh phố Đồng Hới, do ở thănh phố có nguồn nước tốt hơn từ sông Nhật Lệ.Kết quả thể hiện ở bảng 3.1 đê cho thấy bệnh EMS lưu hănh rất phổ biến tại câc vùng nuôi tôm tại tỉnh Quảng Bình. Đê có 100% người được hỏi (n = 120) trả lời rằng họ đê từng gặp bệnh năy ở những năm trước hoặc đang bị bệnh trong quâ trình nuôi tôm. Trong thời gian từ thâng 9/2014 đến thâng 4/2015 đê có 43,33 % câc hộ được phỏng vấn có ao nuôi tôm đang bị bệnh hoặc có dấu hiệu bị bệnh EMS trước khi tôm bị bệnh khâc. Ở câc khu vực điều tra tỷ lệ gặp bệnh năy khâc nhau, trong đó khu vực huyện Bố Trạch có tỷ ệ tôm mắc bệnh cao nhất đến 50%, khu vực Đồng Hới thấp nhất, chỉ 25%.
Để giải thích cho tần số bắt gặp bệnh năy, chúng tôi cho rằng vi khuẩn gđy bệnh EMS có thể tồn tại lđu ngăy trong bùn đây ao, nguồn nước, con giống vă trong tôm bệnh lă nguồn gđy bệnh cho tôm. Cho nín những ao đê bị bệnh EMS nếu cải tạo không kỹ trước khi nuôi rất dễ bị bệnh năy. Đồng thời, tại khu vực 3, người dđn nuôi tập trung quy mô lớn, nguồn lấy nước văo từ kính cấp vă thoât chung cho cả vùng thím văo đó ý thức cộng đồng của người nuôi chưa tốt, nhiều hộ khi có dịch bệnh xảy ra, dấu dịch vă tự ý chữa trị đến lúc không có hiệu quả xả ra môi trường xum quanh, đđy lă nguy cơ lăm bệnh bùng phât vă lđy lan nhanh. Tại khu vực 1 do tốc độ công nghiệp hóa, đô thị hóa vì vậy diện tích nuôi tôm ngăy căng thu hẹp người dđn chủ yếu nuôi trín cât hoặc dọc bờ sông Nhật Lệ vì vậy nguy cơ dịch bệnh xảy ra ít hơn.
Bảng 3.2. Tình hình nhiễm bệnh EMS qua chẩn đoân PCR Địa điểm Số hộ tham gia nghiín cứu Số ao lấy mẫu
Số mẫu kiểm tra Số mẫu bị
nhiễm bệnh Tôm bệnh Tôm khỏe TP Đồng Hới 20 9 24 5 8
Huyện Quảng Ninh 30 9 24 5 12
Huyện Q. Trạch 40 7 21 5 14
Huyện Bố Trạch 30 8 22 5 14
Tổng số 120 33 91 20 48
Nghiín cứu kết quả tôm bị nhiễm bệnh chết sớm ở 4 huyện cho thấy số mẫu lấy ngẫu nhiín trong 33 ao của 120 hộ đang nghiín cứu, với số tôm bị bệnh 91 mẫu vă tôm khỏe 20 mẫu, trong đó có 48 mẫu bị nhiễm VP có AHPNS [+] mang gene sinh độc tố vă hội chứng gan tụy cấp xẩy ra, với tỷ lệ 43,24% số mẫu bị phôi nhiễm vă gđy bệnh tôm chết sớm trong vùng nghiín cứu. Với kết quả năy khẳng định điều người dđn cho rằng tình hình dịch bệnh ngăy căng nghiím trọng.
3.2. ĐẶC ĐIỂM VI KHUẨN V. PARAHAEMOLYTICUS
3.2.1. Dấu hiệu bệnh lý của tôm thu từ ao nuôi
Tôm bệnh hoạt động chậm chạp, bỏ ăn, lờ đờ vă tắp mĩ. Khi tâch bỏ lớp vỏ đầu ngực, quan sât thấy gan tụy teo, dai, nhạt mău, ruột rỗng (Hình 3.2).
Câc dấu hiệu ghi nhận được tương tự trong mô tả của Lightner et al., (2012) vă Flegel et al., (2012) về câc dấu hiệu bệnh lý của tôm khi mắc phải hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính. Lightner (2012) cho biết tôm hoại tử gan tụy ở mức độ ao nuôi thường có một số câc dấu hiệu như tôm chết đây, bỏ ăn, gan tụy teo, dai, nhạt mău, ruột rỗng vă có hiện tượng mềm vỏ. Tôm nuôi có thể chết đột ngột với tỉ lệ cao trong thời gian ngắn sau khi xuất hiện câc dấu hiệu bệnh đặc biệt khoảng sau từ 2 -3 ngăy [20].
3.2.2. Kết quả nuôi cấy vă phđn lập V.parahaemolyticus
Hình 3.3: Nuôi cấy trín môi trường TCBS (trâi); hình thâi của vi khuẩn độ phóng đại
4 x 100 (phải)
Quan sât khuẩn lạc trín môi trường TCBS:
- Khuẩn lạc mău văng =>Vibrio lín men đường Sucrose (V.cholerae,
V.alginolyticus, V.fluvialis….). Khuẩn lạc mău của môi trường ( mău xanh) => Vibrio lín không men đường Sucrose(V.hollisae, Vicus,V.parahaemolyticus..)
- Gram: Phẩy khuẩn Gram đm - Thử nghiệm Oxidase (+)
Thử nghiệm String Test (+): Vi khuẩn tạo thănh sợi (như keo hồ) có thể kĩo dăi khi hòa với Ns 0.85% (nước muối sinh lý).