3. Ý nghĩa khoa học vă thực tiễn
2.4.5. Quy trình PCR
T.W. Flegel vă câc nhă nghiín cứu đê có được thông tin so sânh về trình tự di truyền của vi khuẩn gđy bệnh EMS vă tiến hănh phương phâp phât hiện tâc nhđn gđy nín EMS bằng kỹ thuật PCR với quy trình như sau:
a) DNA từ dạ dăy, ruột hoặc mô gan tụy tôm, từ phđn của tôm bố mẹ hay tôm post, hoặc từ tôm post (nguyín con) hoặc cua còng, giâp xâc trong ao (vật lan truyền
hoặc có thể mang mầm bệnh) hoặc bùn đây ao,… Đối với mẫu vi khuẩn, chúng ta ly tđm 1ml dịch cấy, sau đó lấy nước nổi 2µl để cho văo PCR mix vă chạy PCR.
Đối với DNA phđn lập từ mô tôm bệnh chúng ta tâch chiết theo hướng dẫn, sau đó lấy 2µl để cho văo PCR mix vă chạy PCR.
Bảng 2.3. Chuẩn bị PCR mix: theo bảng dưới đđy
Tube PCR số 1 2 3 4 5 6
PCR mastermix 18µl 18µl 18µl 18µl 18µl 18µl
C[-] 2µl
Tâch chiết DNA M1 2µl
Tâch chiết DNA M2 2µl
Tâch chiết DNA M3 2µl
Tâch chiết DNA M4 2µl
NKAHPNSDNA C[+] 2µl
Bảng 2.4. Chương trình PCR
Chu kỳ Nhiệt độ Thời gian Mục đích
1 400C 10 phút Loại tr ừ ngoại nhiễm
1 950C 15 phút Kích hoạt hotstart taq polymerase
40 950C 20 giđy Biến tính
600C 30 giđy Bắt cặp
720C 01 phút Kĩo dăi
1 720C 10 phút Hoăn tất
b) Điện di:Sản phẩm khuếch đại PCR được chạy điện di trín gel agarose 2% (2 g garose/100 ml dung dịch đệm), sau đó nhuộm bằng dung dịch ethidium bromide, đọc kết quả dưới đỉn UV.
Bảng 2.5. Đọc kết quả
Mẫu 240bps 510bps 382bps 171bps Kết luận
C[-] - - - - Không ngoại nhiễm
C[+] + + + + Độnhạy PCRmix tốt
Mẫu + - - - VP [-], AHPNS [-]
Mẫu + + - - VP [+], AHPNS [-]
Mẫu + ++ ++ ++ VP [+], AHPNS [++]
Mẫu + + + + VP [+], AHPNS [+]
Ghi chú: VP: Vibrio parahaemolyticus; AHPNS: Hội chứng hoại tử gan tụy cấp do nhiễm Vibrio parahaemolyticus mang gín sinh độc tố.
2.4.6. Đọc kết quả vă xử lý số liệu
- Số liệu được được thu nhập vă xử lý sơ bộ trín phần mềm Excel vă xử lý thống kí bằng phần mềm SPSS 18.0. Câc giâ trị sai khâc có ý nghĩa thống kí khi p ≤ 0,05.
- Xâc định vi khuẩn Vibrio parahaemolyticusgđy bệnh tôm chết sớm bằng phđn lập vi khuẩn trín môi trường CHROM agar, TCBS nhằm nắm được đặc điểm sinh lý hình thâi của vi khuẩn năy.
- Xâc định GenVi khuẩn mọc trín hộp thạch phđn lập được gặt văo muối sinh lý vô khuẩn để đạt độ đục 0.5 – 1 McF. Sau đó đun câch thủy sôi trong 10 phút. Để nguôi rồi ly tđm 13.000RPM trong 5’. Lấy 5 ul dịch nổi cho văo PCR mix 45 l chứa sẵn câc thănh phần kể cả cặp mồi 16s – F vă 16s- R. khuếch đại đoạn DNA dăi 527 bps chứa trình tự đặc hiệu loại trín gene 16S của vi khuẩn. Chạy chương trình nhiệt PCR gồm 1 chu kỳ 95oC/5’ để kích hoạt Enzyme hot start Taq Polymerase rồi 40 chu kỳ 94oC/15’’ – 60oC/30’’- 72oC/1’. Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch bằng bộ “Wizard SV Gel and PCR clean – up Sytem” của Promega. Sản phẩm tinh sạch được điện di trín thạch vă sau đó định lượng bằng quang phổ GenQuant của Pharmacia, sau đó được đưa văo phản ứng giải trình tự 2 chiều sử dụng mồi xuôi vă mồi ngược của PCR thực hiện trín bộ thuốc thử “ DTCS cycle sequencing kit “ của Beckman coulter. Chương trình luđn nhiệt của phản ứng giải trình tự với bộ thuốc thử trín lă 30 chu kỳ 90oC/20’’ – 50oC/20’’- 60oC/4’. Sản phẩm của phản ứng giải trình tự được kết tủa bằng ethanol, rồi sau đó được chạy điện di giải trình tự trín mây giải trìn tự CEQ8000. Kết quả giải trình tự được so chuỗi bằn chương trình Blast search trín ngđn hăng dữ liệu gene cyar NCBI. Từ kết quả so chuỗi chúng ta sẽ có được kết quả định danh vi khuẩn.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÍN CỨU VĂ THẢO LUẬN