L ỜI CAM Đ OAN
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Thực trạng và xác định khối lượng vật liệu cháy hiện có ở rừng Thông mã vĩ
Tại 4 địa điểm nghiên cứu ở Cao Bằng tiến hành lập ô tiêu chuẩn (OTC) điển hình, hình chữ nhật có diện tích 500 m2 (25x20) trong mỗi OTC lập 5 ô dạng bản 1 m2 (1mx1m) 4 ô dạng bản ở 4 góc của OTC và 1 ở giữa để xác định khối lượng, thành phần và đặc điểm của vật liệu cháy, sau đó mỗi ô dạng bản ở 3 độ tuổi (<10, 10-20, và >20 tuổi). Khối lượng vật liệu cháy được tính bằng cách thu gom toàn bộ VLC có đường kính nhỏ hơn 1cm ở từng ô dạng bản 1 m2 cân có độ chính xác tới 1g sau đó tính trung bình cho cả OTC (đơn vị tấn/ha).
2.3.2. Phân lập, tuyển chọn vi sinh vật phân hủy xenlulo
2.3.2.1. Phân lập, tuyển chọn và đánh giá các chủng vi sinh vật phân hủy xenlulo có hoạt tính sinh học cao
- Phân lập, tuyển chọn vi sinh vật phân hủy xenlulo có hoạt tính sinh học cao
Phân lập vi sinh vật phân hủy xenlulo thực hiện theo phương pháp của (Skinner, 1960)
Phương pháp cụ thể: Mỗi mẫu cân 10g (đất/thảm mục), sau đó cho vào bình tam giác chứa 90 ml nước muối sinh lý đã được khử trùng. Lắc trên máy lắc trong thời gian 30 phút, để lắng, ta được dung dịch mẫu pha loãng 10-1 lần. Dùng pipetman hút 1ml dịch huyền phù ở độ pha loãng 10-1 đưa vào ống nghiệm chứa 9 ml nước cất vô trùng. Trộn đều ta dịch pha loãng 10-2 lần. Hút 1ml dịch huyền phù ởđộ pha loãng 10-2 đưa vào ống nghiệm chứa 9 ml nước cất vô trùng, trộn đều ta dịch pha loãng 10-3 lần. Tiếp tục làm như trên cho đến khi nồng độ pha loãng đến 10-6 lần. Lấy 0,1 ml dịch ở các nồng độ 10-4 - 10-6 nhỏ và trang đều trên đĩa petri chứa môi trường Gauze và Hans. Để trong tủ ấm ở nhiệt độ 280C trong 24 -48 giờ sao cho có thể thấy rõ các khuẩn lạc riêng biệt. Các khuẩn lạc có màu sắc, hình dạng khác nhau được tách riêng, làm thuần và giữ trong ống nghiệm.
Môi trường phân lập:
+ Môi trường Hans để phân lập và nuôi cấy vi khuẩn phân hủy xenlulo: 0,5 g KH2PO4; 0,5 g K2HPO4; 1 g (NH4)2SO4; 0,1 g MgSO4.7H2O; 0,1 g CaCl2; 6g NaCl; 0,1 g cao nấm men; 0,1 g CMC; 18g Agar, Nước 1000 ml, pH=7
+ Môi trường Gauze I (thay tinh bột tan bằng CMC) để phân lập và nuôi cấy xạ khuẩn phân hủy xellulo 0,5g KH2PO4; 0,5g K2HPO4; 0,1g MgSO4.7H2O; 0,5g NaCl; 0,5g KNO3; 1g FeSO4.7H2O; 20gCMC; 18g Agar, Nước 1000 ml, pH=7
+ Môi trường CMC đặc để xác định hoạt tính phân hủy xellulo 1g CMC;18g Agar, Nước luộc lá thông 1000 ml
+ Dung dịch nước muối sinh lý: 0,85g NaCl; Nước 1000 ml
+ Môi trường PDA phân lập nấm lớn (khoai tây 200g, D-Glucose 20g, Agar 18g, H2O 1000 ml)
Tuyển chọn vi sinh vật phân hủy xellulo có khả năng tồn tại trong môi trường có nhựa thông:
+ Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học bằng phương pháp xác định hoạt tính CMC-aza (Williams, 1983) có bổ sung thêm nhựa thông vào môi trường: Sinh khối các chủng vi sinh vật sau khi nuôi cấy 48 giờ được li tâm, gạn bỏ phần cặn lắng và nhỏ 1ml vào các lỗ thạch đã được chuẩn bị sẵn trên các đĩa petri chứa môi trường CMC đặc. Giữ đĩa thạch trong tủấm 24 giờ, sau đó lấy ra và tráng bề mặt thạch bằng dung dịch lugol. Hoạt tính sinh học được xác định bằng kích thước vòng phân hủy (vòng tròn trong suốt bao quanh lỗ thạch chính là hiệu số giữa đường kính vòng tròn trong suốt (D) và đường kính lỗ thạch (d). + D≥ 35mm: Rất mạnh (++++); + 25mm ≤D <35mm: Mạnh (+++); + 15mm ≤D <25mm: Trung bình (++); + 1mm ≤D <15mm: Yếu(+); + D <1mm: Không hiệu lực (-).
Từ thí nghiệm này chọn được một số chủng VSV phân hủy xenlulo.
- Đánh giá khả năng tồn tại của các chủng vi sinh vật phân hủy xenlulo cao ở trong điều kiện nhiệt độ và ẩm độ khác nhau
Từ các chủng VSV phân hủy xenlulo đã tuyển chọn được tiến hành thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và ẩm độđến sinh trưởng.
Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng. Cấy VSV phân hủy xenlulo vào chính giữa hộp lồng có chứa môi
trường CMC hoặc môi trường chuyên dụng xếp các hộp lồng này vào tủ định ôn có thang nhiệt độ khác nhau 50C± 1; 100C± 1 ; 150C± 1; 200C±1; 250C ± 1; 300C ±1; 350C ±1, 400C± 1 mỗi thang nhiệt độ 10 hộp theo dõi trong 14 ngày cứ 48 giờ đo đường kính một lần (đo hai chiều vuông góc rồi lấy trị số trung bình). Thí nghiệm được lặp lại 3 lần và lấy trị số đường kính bình quân làm đại diện cho thí nghiệm.
Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của ẩm độ không khí đến sinh trưởng của VSV
Phương pháp được tiến hành theo Borth.C pha NaCl với các nồng độ khác nhau trong bình hút ẩm để tạo ra môi trường không khí có độ ẩm không khí (RH%) khác nhau cụ thể như sau:
Công thức CT1 CT2 CT3 CT4 CT5
NaCl(g/1lit) 0 16 32 64 80
RH % 100 90 80 70 60
Dung dịch pha xong đổ vào bình hút ẩm loại lớn mỗi bình 2 lít nước, đậy nắp để trong tối có nhiệt độ 280C, 48 giờ đo đường kính một lần (đo hai chiều vuông góc rồi lấy trị số trung bình). Thí nghiệm theo dõi và thu số liệu trong vòng 10 ngày. Cấy khuẩn lạc vào chính giữa hộp lồng có chứa môi trường CMC, mỗi bình đặt 10 hộp lồng sau 2 ngày đo đường kính nấm theo hai chiều vuông góc và lấy trị số bình quân. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần và lấy trị số đường kính nấm trung bình làm đại diện cho thí nghiệm. Từ thí nghiệm này chọn được 10 chủng có dải nhiệt độ và ẩm độ lớn để tiến hành thí nghiệm tiếp theo.
- Đánh giá khả năng phân hủy xenlulo của vi sinh vật đối với vật liệu cháy (trong bình thí nghiệm)
Từ các chủng VSV có khả năng phân hủy xenlulo tiếp tục thí nghiệm với vật liệu cháy trong phòng thí nghiệm sau đó nhân sinh khối riêng rẽ trên môi
trường lỏng phù hợp để tiến hành thí nghiệm xác định khả năng giảm trọng lượng cơ chất xenlulo tự nhiên của một số chủng VSV. Mỗi chủng VSV được thí nghiệm với 3 bình được lặp lại 3 lần và 1 công thức đối chứng.
Vật liệu cháy cắt nhỏ và điều chỉnh độ ẩm đạt 50 -60%. Mẫu vật liệu sau khi sấy khô kiệt có độẩm coi như bằng không. Để tạo độ ẩm mong muốn phải thêm một lượng nước vào mẫu vật liệu đã khô kiệt. Lượng nước thêm vào được tính theo công thức sau:
Mn = Wct.Pm/100 (trong đó: Mn - lượng nước cần thêm vào (g); Wct - độẩm tuyệt đối cần tạo (%); Pm- trọng lượng vật cháy đã sấy khô kiệt.
Cân 200 g vật liệu cháy cho vào bình tam giác 1000ml. Sau đó bổ sung vào mỗi bình 40ml dịch nuôi cấy lắc vi sinh vật, bình đối chứng bổ sung nước cất. Theo dõi bình ở điều kiện nhiệt độ phòng trong vòng 60 ngày. Sau đó rửa sạch, loại bỏ tạp chất hòa tan và sấy khô phần còn lại chưa phân hủy.
Tỷ lệ giảm trọng lượng của mẫu thí nghiệm so với mẫu đối chứng được tính theo công thức:
X% = (mo-mt)/mo.100
Trong đó: - X: là % độ giảm trọng lượng của mẫu thí nghiệm - mt trọng lượng khô còn lại của mẫu thí nghiệm - mo trọng lượng khô còn lại của mẫu đối chứng
Từ thí nghiệm này chọn ra được 8 chủng VSV có khả năng phân hủy vật liệu cháy cao nhất.
- Đánh giá khả năng phân hủy xenlulo của vi sinh vật trong chậu vại đối với vật liệu cháy
Từ một số chủng VSV có khả năng phân hủy vật liệu cháy tiếp tục thí nghiệm với vật liệu cháy trên quy mô chậu vại sau đó nhân sinh khối riêng rẽ trên môi trường lỏng phù hợp để tiến hành thí nghiệm xác định khả năng giảm trọng lượng cơ chất xenlulo tự nhiên của các chủng VSV trên. Mỗi chủng VSV được thí nghiệm với 3 thùng lặp lại 3 lần và 1 công thức đối chứng.
Cân trọng lượng 10 kg vật liệu cháy cho một thùng ủ. Trước khi ủ vật liệu cháy được thực hiện theo hai phương pháp (làm mềm VLC bằng nước vôi, không xử lý. Bổ sung vào mỗi thùng ủ với 200 ml dịch sinh khối riêng rẽ của từng chủng vi sinh vật phân hủy xenlulo. Công thức đối chứng bổ sung 200 ml nước cất. Đặt thùng ủ ở nơi thoáng, tránh mưa, gió. Sau 48 giờ kiểm tra nhiệt độ thùng ủ một lần và so sánh với mẫu đối chứng (không bổ sung vi sinh vật). Sau 60 ngày, so sánh các chỉ tiêu như độ giảm khối lượng, chiều cao đống ủ, màu sắc, mùi… của các đống ủ có bổ sung vi sinh vật với đống đối chứng. Thí nghiệm này sẽ chọn được ít nhất 5 chủng VSV có hiệu lực tốt nhất để sản xuất chế phẩm.
Tỷ lệ giảm trọng lượng của mẫu thí nghiệm so với mẫu đối chứng được tính theo công thức:
X% = (mo-mt)/mo.100
Trong đó: - X: là % độ giảm trọng lượng của mẫu thí nghiệm - mt trọng lượng khô còn lại của mẫu thí nghiệm - mo trọng lượng khô còn lại của mẫu đối chứng
2.3.2.2. Phương pháp định danh đến loài và xác định mức độ an toàn sinh học của các chủng vi sinh vật có hoạt tính cao được tuyển chọn
Từ một số chủng VSV phân hủy xenlulo giám định tên VSV bằng phương pháp sinh học phân tử dựa trên cơ sở giải trình tự đoạn gen 16S hoặc 28S ARN riboxom của các chủng VSV nghiên cứu, so sánh các trình tự có sẵn trong ngân hàng gen quốc tế EMBL bằng phương pháp FASTA 33 để định loại đến loài các chủng VSV được xác định với hệ số tương đồng cao nhất.
Phương pháp định danh vi khuẩn
Định danh vi khuẩn bằng sinh học phân tử: Từ các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường PDA, tiến hành tách ADN theo các bước sau:
Tách chiết ADN: Sinh khối được chia nhỏ và đưa vào ống eppendorf 1,5 ml đã bổ sung 500 µl 2 × SSC. Lắc đều và ủở 990C trong 10 phút. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 2 phút. Hút bỏ phần dịch và tiến hành rửa tế bào 1 lần bằng nuớc cất vô trùng. Thêm khoảng 100 µl hạt thủy tinh có đường kính 0,2 - 0,5 mm (Roth, Đức), 100 µl dung dịch phenol/chloroform (tỉ lệ 1 : 1) và 100 µl nước cất vô trùng. Lắc ở 1.400 vòng/phút trong 10 phút trên máy Thermocomfort (Eppendorf, Đức) sau đó ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút. Lấy phần dịch trong phía trên có chứa ADN làm khuôn cho phản ứng PCR. ADN sau khi tách chiết được giữ ở - 20°C.
Phân loại sinh vật bằng giải trình tự: Phân đoạn rADN của vi khuẩn được khuếch đại trên thiết bị C1000 TouchTM Thermal Cycler (Bio-Rad, Mỹ) với chương trình nhiệt được thiết lập với pha biến tính ở 940C trong 3 phút kế tiếp là 30 chu kỳ nhiệt (940C trong 40 giây, 520C trong 40 giây và 720C trong 2 phút). Quá trình khuếch đại được hoàn tất ở 720C trong 10 phút và sau đó sản phẩm PCR được bảo quản ở 100C.
Sản phẩm PCR sau khi khuếch đại được phân tích trình tự tại hãng 1st BASE (Malaysia). Các chuỗi ADN được so sánh với cơ sở dữ liệu của GenBank thông qua giao diện tìm kiếm giao diện tìm kiếm BLAST nucleotide-nucleotide đặt tại National Center for Biotechnology Information, Bethesda, Mỹ: http://www.ncbi.nlm.nih.gov hoặc http://www.ezbiocloud.net/. Mồi sử dụng trong phân loại:
16s27F trình tự (5’→3’): 5' TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3'; 16s1492R: 5' TCCTCCGCTTATTGATATGC 3'.
Xây dựng cây phát sinh chủng loại: Xây dựng cây chủng loại phát sinh: trình tự ADN ribosome 16s của chủng nghiên cứu và những trình tự tương đồng với chúng được chuyển tải về sau đó xử lý bằng phần mềm BioEdit (Hall, 1999). Sau đó công cụ Muscle (Edgar, 2004) trong chương trình MEGA 7 (Kumar et al., 2016) được sử dụng để so sánh sắp xếp các trình tự. Cây phát sinh chủng loại được xây dựng dựa trên sự biến đổi về khoảng cách sai khác trình tự theo Kimura (1980), sử dụng phương pháp neighbour - joining (Saitou & Nei, 1987) trong MEGA. Chương trình phân tích được thực hiện từ 1.000 dữ liệu lấy ngẫu nhiên (Felsenstein, 1985). Thanh chèn trong cây phân loại thể hiện % sự khác biệt giữa các trình tự phân tích.
2.3.3. Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm sinh học
2.3.3.1. Phương pháp nghiên cứu điều kiện sinh trưởng và phát triển của các chủng VSV sử dụng trong sản xuất chế phẩm vi sinh
- Phương pháp xác định môi trường nuôi cấy phù hợp: Thí nghiệm được thực hiện với 3 loại môi trường khác nhau với tốc độ lắc (150 vòng/phút), nhiệt độ ở 280C, thời gian lắc 72 giờ, bình tam giác 500 ml thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
- Phương pháp xác định tốc độ lắc phù hợp: Được thực hiện với 5 công thức ở các tốc độ lắc khác nhau (0, 100, 150, 200, 250 vòng/phút) mỗi tốc độ lắc 10 bình tam giác 500 ml thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Cho một lượng VSV vào các bình lắc ở các tốc độ khác nhau, nhiệt độ ở 280C, thời gian lắc 72 giờ.
- Phương pháp xác định thời gian nhân sinh khối phù hợp: Được thực hiện với 5 công thức ở các thời gian nuôi cấy khác nhau (24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ và 120 giờ) mỗi công thức 10 bình tam giác 500 ml, thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Cho một lượng VSV như nhau sau lắc với tốc độ 150 vòng/phút ở nhiệt độ 280C.
- Phương pháp xác định nhiệt độ nhân sinh khối phù hợp: Được tiến hành với 8 công thức ở các thang nhiệt độ khác nhau (150C, 200C, 250C, 300C, 350C, 400C, 450C, 500C) mỗi thí nghiệm 10 bình tam giác 500 ml, thí nghiệm được lặp lại 3 lần. VSV vào các bình lắc với tốc độ 150 vòng/phút với thời gian lắc 72 giờ. Lấy các bình đã lắc mỗi loại ra một ít làm mẫu, đếm số khuẩn lạc bằng phương pháp pha loãng tới hạn. Đếm số lượng khuẩn lạc ở các công thức khác nhau bằng phương pháp pha loãng tới hạn.
- Phương pháp xác định pH nhân sinh khối phù hợp: Được tiến hành với 6 dải pH cụ thể như sau: 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0 mỗi thí nghiệm 3 bình tam giác 500 ml, thí nghiệm được lặp lại 3 lần. VSV vào các bình lắc với tốc độ 150 vòng/phút với thời gian lắc 72 giờ. Đếm số khuẩn lạc bằng phương pháp pha loãng tới hạn (Nguyễn Lân Dũng và Phạm Văn Ty, 1998).
2.3.3.2. Phương pháp nghiên cứu khả năng tập hợp các chủng VSV
Sử dụng phương pháp cấy vạch để đánh giá mối quan hệ các chủng vi sinh vật được lựa chọn, xem chúng có đối kháng nhau hay không ? Các chủng VSV được cấy thành các đường thẳng vuông góc, mỗi chủng đều cắt nhau tại nhiều điểm. Nuôi cấy ở 280C trong vòng 24 đến 48 giờ. Từ thí nghiệm này chọn được 1-2 chủng VSV có khả năng phân hủy tốt với VLC dưới tán rừng thông.
2.3.3.3. Phương pháp tạo chế phẩm sinh học
- Một số chất mang được đưa vào thử nghiệm như chất mùn hữu cơ/than bùn/tinh bột sắn/apatit… được thử nghiệm để sản xuất chế phẩm. Thành phần và tỷ lệ phối trộn các chất mang của chế phẩm được thực hiện theo 5 công thức (mật độ VSV 107 CFU/gam chế phẩm).