L ỜI CAM Đ OAN
3.2.2. Đánh giá khả năng tồn tại của các chủng vi sinh vật phân hủy xenlulo ở trong
xenlulo ở trong điều kiện nhiệt độ và ẩm độ khác nhau
3.2.2.1. Đánh giá khả năng tồn tại của các chủng vi sinh vật phân hủy xenlulo ở
trong điều kiện nhiệt độ
Nhiệt độ không khí ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của VSV phân giải xenlulo. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ không khí đến sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật phân giải xenlulo có ý nghĩa rất lớn trong việc sản xuất chế phẩm, trên cơ sởđó chọn các chủng VSV có biên độ sinh thái lớn. Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng và phát triển của VSV phân giải xenlulo được tiến hành với 8 thang nhiệt độ khác nhau (50C; 100C; 150C; 200C; 250C; 300C; 350C; 400C) mỗi thí nghiệm 3 hộp lồng 3 lần lặp. Sinh trưởng của vi sinh vật được trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của nhiệt độđến sinh trưởng của VSV phân giải xenlulo
Stt Chủng vi sinh Đường kính khuẩn lạc (cm) Fps Lsd 5ºC 10ºC 15ºC 20ºC 25ºC 30ºC 35ºC 40ºC 1 CBK8 1,2a 2,4b 2,8c 3,0cd 3,5e 3,1d 2,9cd 2,5b <.001 0.2214 2 CBK11 1,0a 1,5b 1,9cd 2,1de 3,2g 2,5f 2,2e 1,7bc <.001 0.2141 3 CBK12 1,1a 1,1a 2,1c 2,8e 3,0f 2,3d 1,7b 1,6b <.001 0.1979 4 CBK17 1,0a 1,1a 1,6b 2,2c 3,5f 3,0e 2,6d 1,6b <.001 0.1992 5 CBK18 1,1a 1,2a 1,8b 2,6c 3,6d 3,4d 2,5c 1,7b <.001 0.2188
Qua số liệu bảng 3.4 nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng, phát triển của hệ sợi nấm. Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng và phát triển VSV được tiến hành với 8 thang nhiệt độ khác nhau (100C, 150C, 200C, 250C, 300C, 350C, 400C) tốc độ sinh trưởng phát triển của VSV ở các thang nhiệt độ khác nhau có sự khác nhau rõ rệt. VSV phát triển được trên môi trường nuôi cấy thuần khiết trong khoảng nhiệt độ từ 15 - 350C, khoảng nhiệt độ thích hợp cũng ở khoảng 25- 300C các chủng VSV sinh trưởng phát triển tốt. Khi nhiệt độ dưới 100C và trên 350C các chủng VSV phát triển chậm hoặc không phát triển.
3.2.2.2. Đánh giá khả năng tồn tại của các chủng vi sinh vật phân hủy xenlulo ở
Tiến hành thí nghiệm 5 chủng VSV với các thang ẩm độ khác nhau: 60%;
70% ; 80%; 90%; 100% mỗi thang nhiệt độ 10 đĩa Petri 3 lần lặp theo dõi trong
vòng 6 ngày kết quảđược trình bày ở bảng 3.5.
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của ẩm độđến sinh trưởng của vi sinh vật phân giải xenlulo
Stt Chủng vi sinh Đường kính (cm) Fps Lsd 60% 70% 80% 90% 100% 1 CBK8 2,5a 3,8c 3,1b 3,6c 2,4a <.001 0.2545 2 CBK11 1,7a 2,8c 2,2b 3,0d 1,6a <.001 0.1658 3 CBK12 1,4a 3,2c 2,6b 2,7b 1,5a <.001 0.1641 4 CBK17 1,8b 2,5d 2,2c 2,5d 1,5a <.001 0.1578 5 CBK18 1,9b 2,7d 2,4c 3,0e 1,6a <.001 0.1461
Qua số liệu bảng 3.5 ẩm độ ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng, phát triển của hệ sợi nấm. Thí nghiệm ảnh hưởng của độ ẩm đến sinh trưởng và phát triển của hệ
sợi nấm được tiến hành với 5 thang ẩm độ khác nhau (60%, 70%, 80%, 90%, 100%)
tốc độ sinh trưởng phát triển của của các chủng VSV ở các độẩm khác nhau và có sự khác nhau rõ rệt. VSV phát triển được trên môi trường nuôi cấy thuần khiết trong khoảng ẩm độ từ 60-100%, khoảng độẩm thích hợp nhất là 80-90%.
3.2.2.3. Đánh giá khả năng phân hủy xenlulo của VSV đối với vật liệu cháy (trong
bình thí nghiệm)
Đánh giá khả năng phân hủy xenlulo của VSV đối với vật liệu cháy (trong bình
thí nghiệm) được thực hiện với 5 chủng VSV (CBK8; CBK11; CBK12; CBK17;
CBK31) kết quảđược trình bày ở bảng 3.6.
Bảng 3.6: Khả năng phân giải VLC của các chủng VSV trong bình thí nghiệm
Stt Ký hiệu chủng 20 ngày 40 ngày 60 ngày
X% X% X% 1 CBK8 2,9 5,0 11,9 2 CBK11 2,8 4,9 9,3 3 CBK12 2,6 4,7 8,9 4 CBK17 2,2 4,1 7,4 5 CBK18 2,3 4,5 8,5 6 ĐC 0.6 1.0 1.9 Fpr <0.001 <0.001 <0.001 Lsd 0.1715 0.2259 0.23
Qua số liệu bảng 3.6 trên cho thấy các chủng VSV khác nhau có khả năng phân giải xenlulo khác nhau trong điều kiện ở bình thí nghiệm trong thời gian 20 ngày khả năng phân giải xenlulo chỉ đạt từ 2,6 đến 3,3% trong khi đó công thức đối chứng chỉ đạt 0,6%. Ở thời điểm 40 ngày khả năng phân giải xenlulo từ 4,7 đến 6,2% trong khi đó ở công thức đối chứng khả năng phân giải chỉ đạt 1,0. Ở thời
điểm 60 ngày thí nghiệm khả năng phân giải xenlulo của các chủng VSV trong bình thí nghiệm đạt từ 7,9% đến 11,9% trong khi đó đối chứng khả năng phân hủy rất thấp 1,9%.
3.2.2.4. Đánh giá khả năng phân hủy xenlulo của VSV đối với vật liệu cháy (quy mô
chậu vại)
Đề tài tiếp tục thử nghiệm 4 chủng vi sinh vật phân giải xenlulo tốt nhất để
tiếp tục thử nghiệm với VLC trong thùng nhựa với quy mô lớn hơn (10kg/thùng) kết quảđược trình bày ở bảng 3.7.
Bảng 3.7: Khả năng phân giải vật liệu cháy của các chủng VSV trong chậu vại quy mô 10kg/thùng
TT Tên chủng
Thời gian phân giải Vật liệu cháy
2 tháng 4 tháng 6 tháng X% X% X% 1 CBK8 14,2 29,7 53,6 2 CBK11 13,8 28,8 51,3 3 CBK12 12,6 26,2 52,6 4 CBK17 12,8 23,5 48,5 5 ĐC 4,7 8,5 13,6 Fpr <0.001 <0.001 <0.001 Lsd 0.2891 1.716 0.3016
Qua số liệu bảng 3.7 trên cho thấy các chủng VSV khác nhau có khả năng
phân giải xenlulo ở các công thức khác nhau là khác nhau trong điều kiện ở chậu vại (thùng nhựa) trong thời gian 2 tháng khả năng phân giải xenlulo đạt từ 13,8 đến
18,53%. Trong thời gian 4 tháng khả năng phân giải xenlulo đạt 23,5 đến 29,7%. Ở
thời gian 6 tháng VSV phân giải xenlulo đối với VLC trong thùng thí nghiệm đạt từ
48,5 đến 53,6% trong khi đó công thức đối chứng khả năng phân giải rất thấp đạt
khả năng phân giải vật liệu cháy tốt nhất để tiến hành định danh bằng sinh học phân tử:
Định danh các chủng có khả năng phân giải xenlulo cao bằng sinh học phân tử
Chủng CBK8, CBK11, CBK12
Hình 3.3Vị trí phân loại của chủng CBK8, CBK11, CBK12 với các loài có quan hệ họ hàng gần thuộc chi Bacillus
Cây phân loại được xây dựng dựa trên trình tự ADN ribosome 16s của chủng Bacillus subtilis CBK8 và những loài đã biết thuộc chi Bacillus bằng việc sử dụng phần mềm MEGA7 theo phương pháp Kimura 2-parameter.
Việc so sánh được thực hiện theo 1000 lần gieo quẻ ngẫu nhiên. Brevibacillus brevis được sử dụng như nhóm ngoài. Thanh chèn tương ứng 1% sự khác biệt. Trình tự gen rARN 16S của chủng CBK8 tương đồng với đoạn 16S của vi khuẩn Bacillus subtilis.
Chế phẩm vi sinh vật Bacillus có khả năng phân giải cellulose nhờ khả năng sinh trưởng nhanh, tạo nhiều enzyme; chủng V40 có khả năng sinh enzyme celulase tốt nhất đã được xác định là Bacillus subtilis (Trần Liên Hà
et al., 2019). Một kết quả nghiên cứu trước đó cũng chỉ ra rằng, Bacillus subtilis C7 có khả năng sinh các enzyme cellulase, phylase để thủy phân cellulose và phytate trong bã sắn (Mạch Trần Phương Thảo et al., 2014). Không chỉ vậy, nghiên cứu phân giải bã mía cũng cho thấy, tổ hợp giữa 2 dòng vi khuẩn DD9 (Bacillus subtilis RC24) và DD7 (Bacillus subtilis BA3- 1A) phân giải bã mía hiệu quả nhất với đường kính vòng tròn thủy phân lớn nhất lên tới 27 mm (Võ Văn Song Toàn et al., 2014). Trong phân giải cellulose, hoạt lực cenlulase là yếu tố thiết yếu, theo nghiên cứu về vi khuẩn có hoạt tính cellulase cao, Bacillus subtilis TD phân giải cellulose tốt nhất với hoạt lực cenlulase lên tới 8,52 U/ml (Vũ Thị Dinh et al., 2018). Ngoài ra,
Bacillus sutilis BTN7A cũng được dùng để cải thiện sự phân hủy cellulose bằng cách nhân bản endo-b-1, 3-1, 4 gen glucanase (bgls) (Wafaa K. Hegazy
et al., 2018). Không những có khả năng phân giải cellulose, Bacillus subtilis
BA02 còn có tiềm năng phòng trừ bệnh nấm cây trồng. Bacillus subtilis được biết đến như một tác nhân kiểm soát sinh học có hiệu quả cao đối với nhiều loại nấm và vi khuẩn gây bệnh trên cây trồng. (Nguyễn Lý Nhơn et al., 2013);
Bacillus subtilis QST713 phân hủy cellulose, tăng cường sự hấp thu phốt pho trong khi cải thiện phản ứng sinh học kẽm trong lúa mì (Aurora Moreno-Lora
Hai chủng CBK11 và CBK12 tương đồng 100% với loài so với loài
Bacillus megaterium. nhiều nghiên cứu khác cũng cho thấy khả năng phân giải cellulose của chủng vi khuẩn này. Bacillus megaterium có tế bào hình que, Gram dương, nội bào tử và có khả năng thủy phân cellulose (Saha et al., 2006). Bốn dòng vi khuẩn Q4, Q5, Q8 và Q9 được phân lập từ dịch dạ cỏ bò đều có khả năng sản sinh hiệu quả enzyme cellulase ngoại bào (endoglucanases, exoglucanases và β-glucosidases) ở điều kiện kỵ khí. Phân tích di truyền phân tử dựa trên trình tự 16S rRNA cho thấy dòng vi khuẩn Q5 tương ứng Bacillus megaterium M530013) (Võ Văn Phước Quệ, Cao Ngọc Điệp, 2011). Ở một nghiên cứu khác, Bacillus megaterium STB1 cũng được biết đến là một loại vi khuẩn bào tử Gram dương, màu vàng nhạt, có thể phát triển từ 70C đến 450C. Nó là một loại vi khuẩn catalase dương tính và vận động, có thể sử dụng glucose và lactose làm nguồn các bon, nhưng không lên men. Cũng theo nghiên cứu này, vi khuẩn Bacillus megaterium còn sản xuất một số enzyme ngoại bào bao gồm protease, cellulase và amylase, nhưng không phải lipase hay esterase trong các điều kiện được thử nghiệm (E. Glickmann & Y. Dessaux, 1995). Kết quả này cho thấy, Bacillus megaterium không chỉ có khả năng sản xuất enzyme cellulase phân hủy cellulose mà còn là một chủng đa tác dụng với nhiều chức năng hữu ích. B. megateriumđã được công nhận là một endophyte và là một tác nhân tiềm năng cho việc kiểm soát sinh học các bệnh thực vật. Khả năng cố định đạm cũng đã được chứng minh ở một số chủng B. megaterium (De Vos, P. et al. 2009). B. megaterium ST2-9 còn được nhắc tới với khả năng chịu mặn và có chức năng kích thích sinh trưởng cây trồng nhờ tổng hợp hormone thực vật Indole-3-Acetic Acid (IAA) (Nguyễn Khởi Nghĩa, Nguyễn Thị Kiều Oanh, 2017). Cadmium (Cd) là một trong ba kim loại được coi là nguy hiểm nhất đối với cơ thể con người (hai thứ còn lại là chì và thủy ngân). Nghiên cứu thử nghiệm Bacillus megaterium BM18-2 (đột biến), và BM18, cả hai đều làm
giảm đáng kể tác dụng độc hại của Cd và hiệu quả của ‘BM18-2, trong việc thúc đẩy tăng trưởng thực vật với sự hiện diện của Cd trong đất tốt hơn đáng kể so với BM18 (Juanzi Wua et al., 2019). Polyacrylamide thủy phân (HPAM) là polymer tuyến tính hòa tan trong nước được sử dụng rộng rãi nhất với trọng lượng phân tử cao. Suy thoái vi sinh là một phương pháp thân thiện với môi trường và hiệu quả để xử lý nước sản xuất có chứa HPAM. Trong nghiên cứu về vấn đề này, một chủng SZK-5 có thể làm suy giảm HPAM đã được phân lập từ đất bị ô nhiễm bởi nước khai thác dầu. Dựa trên các đặc điểm hình thái, sinh hóa và phân tích tương đồng trình tự 16S rDNA, chủng này được xác định là Bacillus megaterium (Tianwen Song et al., 2019). Ngoài ra, chủng Bacillus megaterium còn có khả năng xử lý nước ao nuôi cá Tra (Lê Văn Nhật et al., 2013). Đặc biệt hơn, B. megaterium STB1 thúc đẩy đáng kể sự phát triển của cây cà chua trong cả điều kiện bình thường và khắc nghiệt, dẫn đến tăng sự phát triển của rễ, chồi và lá. Cấy B. megaterium STB1 vào cây cà chua dẫn đến sự gia tăng đáng kể gấp 3,5 lần trong rễ (32 so với 108 mg) và khối lượng khô (49,9 so với 187,4 mg), dẫn đến tăng tổng lượng cà chua khô sinh khối (81,9 so với 295,8 mg) khi so sánh với đối chứng không tiêm chủng, trong điều kiện bình thường. Đây là một chủng linh hoạt với đa tác dụng có tiềm năng lớn ứng dụng cho nông nghiệp và công nghệ sinh học. (Francisco X. Nascimento et al., 2020).
Cả 2 chủng Bacillus subtilis và Bacillus megaterium đều đã được các nhà khoa học nghiên cứu để ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học trước đó. Cụ thể là chế phẩm sinh học Biochie bao gồm một số chủng thuộc chi Bacillus (Bacillus subtilis, Bacillus megaterium,...). chúng có chức năng phân hủy hợp chất hữu cơ thải ra từ thức ăn thừa và uế thải nhờ khả năng tổng hợp enzyme phân hủy hữu cơ. Chúng còn có khả năng tổng hợp chất kháng khuẩn làm giảm số lượng vi sinh vật gây bệnh phát triển quá mức như Vibro, Aeromonas (Võ Thị Thứ et al., 2004). Như vậy, đây là các loài vi khuẩn có
mức độ an toàn sinh học cao được nghiên cứu và ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực khác nhau như công nghiệp, nông nghiệp và lâm nghiệp.