Xác định chỉ tiêu sinh lý máu

Phân tích chỉ tiêu sinh lý 30 mẫu máu bò dương tính với Anaplasma spp. Mẫu được phân tích tự động trên máy huyết học Hema Screen 18 tại Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ sinh học Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.

3.5.11. Phƣơng pháp thử nghiệm thuốc diệt ve ký sinh trên bò

Thử nghiệm hiệu lực của thuốc diệt ve bằng phương pháp thực nghiệm.

3.5.11.1. Thử nghiệm hiệu lực diệt ve trong phòng thí nghiệm được bố trí như sau

Hợp chất bán tổng hợp Pyrethroid dẫn xuất chính là Permethrin do viện Sốt rét- Ký sinh trùng – Côn trùng Trung Ương cung cấp. Thuốc được dựng trong lọ màu tối, thuốc tồn tại dưới dạng nhũ tương đậm đặc có màu trắng. Thử nghiệm được pha với nước thành các nồng độ 1%, 3%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, sau khi pha thuốc đươc bảo quản trong lọ thủy tinh có nắp đậy kín. Thử nghiệm thuốc ở tất cả các nồng độ với mẫu ve trưởng thành, ấu trùng, thiếu trùng thu thập từ thực địa. Số lượng ve thử nghiệm theo là 30 ấu trùng, 30 thiếu trùng, 30 trưởng thành.

Phương pháp thử nghiệm: nhúng vào dung dịch thuốc sau đưa ra để theo dõi tác dụng gây độc của thuốc qua các mốc thời gian: 24 giờ, 48 giờ. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

Dùng 40 đĩa petri có đường kính 5 cm. Trong đó: 10 đĩa chứa thuốc ở nồng độ từ 1 đến 10%, mỗi đĩa chứa 20 ml thuốc. Mỗi giai đoạn của ve sau khi cho

tiếp xúc với thuốc được giữ trong các đĩa petri tiếp tục theo dõi tác dụng của thuốc qua các mốc thời gian.

Các giai đoạn của ve được xác định là đã chết khi không còn cử động, co thể bị teo lại sau thời gian từ 24 giờ đến 48 giờ;

Lô đối chứng: mỗi giai đoạn của ve đều bố trí lô đối chứng, dung dịch đối chứng là nước cất, PH = 7,2.

3.5.11.2. Thử nghiệm diệt ve trên cơ t ể bò bằng hóa chất Permethrin

- Trước khi thí nghiệm trên bò, tiến hành triển tra triệu chứng lâm sàng, đo nhịp tim, tần số hô hấp của bò bằng tai nghe thú y;

- Chọn 3 bò nhiễm các giai đoạn của ve với cường độ cao, đếm số lượng các giai đoạn ve ở từng bò. Kiểm tra một số chỉ tiêu lâm sàng của bò trước khi dùng hóa dược diệt ve.

- Diệt ve trên cơ thể bò theo phương pháp phun thuốc vào những vùng có ve ký sinh như cổ, thân, chân.

- Cách phun thuốc: dùng bình phun loại có dung tích 1 lít (1000ml) có hệ thống bơm tạo áp suất. Pha thuốc vào bình có khối lượng 1000ml, bơm tạo áp suất tới tối đa. Phun vào vùng có các giai đoạn của ve ký sinh trừ phần đầu, mắt, miệng của bò. Phun theo hướng từ dưới lên. Sau khi phun thuốc kiểm tra ve trên cơ thể bò và dưới đất, thu thập các giai đoạn của ve.

- Đánh giá hiệu lực diệt ve sau 24 giờ, 48 giờ qua sự sống, chết cả các giai đoạn của ve.

Đánh giá sự an toàn của hóa dược với sức khỏe bò sau phun thuốc 6 giờ qua theo dõi một số chỉ tiêu lâm sàng của bò: thân nhiệt, hô hấp, thần kinh: chảy nước dãi, đồng tử mắt, run giật.

3.6. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU

Dung lượng mẫu được tính ở phần mềm Win Episcope 2.0. Xử liệu xử lý phần mềm R phiên bản 4.0.2

Phân tích mối liên quan giữa tỷ lệ nhiễm Ve và ký sinh trùng đường máu với các biến độc lập bao gồm loại bò, mùa, vùng, tuổi bằng phân tích hồi quy logistic.

Các giá trị được tính là tỷ suất chênh (OR), khoảng tin cậy (CI95%) của tỷ suất chênh.

PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. TÌNH HÌNH NHIỄM KÝ SINH TRÙNG ĐƢỜNG MÁU DO VE TRUYỀN Ở ĐÀN BÕ NUÔI TẠI HUYỆN BA VÌ, THÀNH PHỐ HÀ NỘI 4.1.1. Thành phần, tỷ lệ nhiễm ký sinh trùng đƣờng máu do ve truyền trên đàn bò

Sử dụng phương pháp nhuộm giemsa đối với mẫu máu bò thu thập ở vùng nghiên cứu, căn cứ vào hình thái màu sắc và vị trí ký sinh của ký sinh trùng đường máu trong hồng cầu bò, chúng tôi đã xác định bò nuôi tại huyện Ba Vì nhiễm loài ký sinh trùng ở bảng 4.1.

Bảng 4.1. Tỷ lệ nhiễm ký sinh trùng đƣờng máu do ve truyền trên bò Loài ký sinh trùng Số kiểm tra (con) Số nhiễm (con) Tỷ lệ nhiễm (%) Anaplasma spp 1270 336 26,46 Babesia spp 1270 0 0 Theileria spp 1270 0 0 Tổng 1270 336 26,46

Trong 1270 mẫu máu bò được khảo sát, tỷ lệ nhiễm ký sinh trùng đường máu là 26,46%. Trong tất cả mẫu kiểm tra chỉ thấy nhiễm Anaplasma spp. và không tìm thấy Theileria spp. và Babesia spp (bảng 4.1).

STT Họ Chi Loài Mẫu Chủng

Số Ngân

hàng gen Nguồn gốc

Tài liệu tham khảo tham chiếu

29 Ehrlichia muris (AS145) U15527 Hoa Kỳ Wen & cs., 1995 30 Ehrlichia chaffeensis (Arkansas) M73222 Hoa Kỳ Aderson & cs., 1991 31 Ehrlichia minasensis (UFMG-EV) NR148800 Brazil Cabezas-Cruz & cs.,

2016 32 Ehrlichia canis (E60) AB723709 Nhật Bản GenBank

33 Ehrlichia canis (ZKK21) KP745631 Thổ Nhĩ Kỳ Aktas & cs., 2015 34 Ehrlichia canis (002)a KR920044 Malaysia Koh & cs., 2018 35 Ehrlichia canis (171) KC479023 Nam Phi GenBank 36 Ehrlichia canis (ECANBkk07) EU263991 Thái Lan GenBank

Wolbachia

37 Wolbachia pipientis (E-Ghent) AF179630 Bỉ Vandekerckhove & cs., 1999

Neorickettsia

38 Neorickettsia

helminthoeca N/A U12457 Hoa Kỳ Pretzman & cs., 1995 39 Neorickettsia

helminthoeca (Roxy1) KX462531 Hoa Kỳ Greiman & cs., 2016 40 Neorickettsia risticii (812) KX001784 Achentina Cicuttin & cs., 2017 41 Neorickettsia sennetsu (11908) M73225 Malaysia Aderson & cs., 1991 42 Neorickettsia sennetsu (Miyayama) NR044746 Nhật Bản Aderson & cs., 1991

Rickettsiaceae

Rickettsia

43 Rickettsia marmionii (KB) AY737685 c Unsworth & cs., 2007 44 Rickettsia rickettsii (Sawtooth) U11021 Hoa Kỳ Stothard & cs., 1994

Ghi chú: chuỗi Anaplasma spp. sử dụng cho phân tích tính toán khoảng cách di truyền pairwise genetic distance) (liệt kê ở Bảng 4.15). N A: không có

Khoảng cách di truyền của Anaplasma spp.

Khoảng cách di truyền được tính toán bằng cách so sánh từng cặp trình tự 16S rDNA trong các chủng của từng loài A. marginale và A. platys. Tinh toán khoảng cách di truyền cũng được thực hiện giữa các loài A. marginale 7 từ Việt Nam và hai trình tự làm tham chiếu và A. platys 3 từ Việt Nam và hai tham chiếu và từ A. bovis và A. phagocytophilum Bảng 4.14 . Trong nhóm A. marginale, trình tự của 7 mẫu của Việt Nam khác nhau trong khoảng 0 và 0,2 – 0,4% so với trình tự đối chứng chủng A. marginale của Trung Quốc và Nam Phi Guo & cs., 2016; Lew & cs., 2003 . Kết quả cũng cho thấy sai khác 0,2 – 0,4 với các chủng của Trung Quốc và Nam Phi Bảng 4.15 .

Bảng 4.15. Tính toán khoảng cách di truyền ( ) dựa trên phân tích

chu i gen 16S rDNA giữa Anaplasma spp. mẫu của Việt Nam và

các chủng loài tham chiếu đã công bố hoặc có trong Ngân hàng gen

Loài Chủng Anaplasma spp. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 A. marginale-(ANA25BV)- Vietnam 2 A. marginale-(ANA88)- Vietnam 0.0 3 A. marginale-(BS27)- Vietnam 0.0 0.0 4 A. marginale-(BS255)- Vietnam 0.0 0.0 0.0 5 A. marginale-(BV1)- Vietnam 0.0 0.0 0.0 0.0 6 A. marginale-(BVHD1)- Vietnam 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 7 A. marginale-(BVHD2)- Vietnam 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 8 A. marginale- (WHANSA19)-China 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 9 A. marginale-(Eland)-South Africa 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.6 10 A. bovis-(Y257)-Australia 4.6 4.6 4.6 4.6 4.6 4.6 4.6 4.8 5.0 11 A. platys-(ANA111)- Vietnam 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.2 3.4 2.8 12 A. platys-(BVHD4)- Vietnam 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.2 3.4 2.8 0.0 13 A. platys-(C9BV)-Vietnam 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.4 3.6 3.0 0.2 0.2 14 A. platys-(Apl87)-Germany 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.2 3.4 2.8 0.0 0.0 0.2 15 A. platys-(Dog1)- Philippines 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.2 3.4 2.8 0.0 0.0 0.2 0.0 16 A. phagocytophilum- (KZA1)-South Korea 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4 2.6 2.8 3.6 1.0 1.0 1.2 1.0 1.0 Ghi chú: Khoảng cách di truyền giữa các trình tự nội loài của A. marginale và A. platys này được bôi

màu và đóng khung. Vietnam: Việt Nam; China: Trung Quốc; South Africa: Nam Phi; Australia: c; Germany: Đức; Phillipines: Phillipin; South Korea: Hàn Quốc.

Trình tự của A. platys Việt Nam có khoảng cách di truyền < 0,2 so với các chủng đối chứng của Đức Dyachenko & cs., 2012) và Philippines (GenBank: KP006397 . Khoảng cách di truyền giữa các loài A. marginale và Anaplasma

spp. khác là: 4,6% – 5,0 với A. bovis); 2,8% – 3,6 với

Anaplasmasp-(AEP1007-ZA2013)-South Africa-KY287600

Anaplasma marginale-(4C)-Philippines-JQ839008

Anaplasma marginale-(23-ZW)-Zimbabwe-AF414878

Anaplasma marginale-(C6A)-Philippines-JQ839012

Anaplasma marginale-(WHANSA19)-China-KU585981

Anaplasma marginale-(Eland)-South Africa-AF414872

Anaplasma marginale-(ANA25BV)-Vietnam-MH686041(indigenous)

Anaplasma marginale-(ANA88)-Vietnam-MH686042(indigenous)

Anaplasma marginale-(BS255)-Vietnam-MH686044(hybrid dairy)

Anaplasmamarginale-(BS27)-Vietnam-MH686043(hybrid dairy)

Anaplasma marginale-(BV1)-Vietnam-MH686045(indigenous)

Anaplasmamarginale-(BVHD2)-Vietnam-MH686047(indigenous)

Anaplasma marginale-(BVHD1)-Vietnam-MH686046(indigenous)

Anaplasma phagocytophilum-(Webster)-United States-U02521

Anaplasma phagocytophilum-(KZA1)-South Korea-KT986058

Anaplasma bovis-(Y257)-Australia-KY425445

Anaplasma platys-(WHANSA63)-China-KU585997

Anaplasma platys-(C9BV)-Vietnam-MH686050(domestic dog)

Anaplasma platys-(1)-Malaysia-JF683610

Anaplasma platys-(4618)-Thailand-JN853776

Anaplasma platys-(Apl87)-Germany-JQ396431-Germany

Anaplasma platys-(Dog1)-Philippines-KP006397

Anaplasma platys-(Sommieres)-France-AF303467

Anaplasma platys-(ANA111)-Vietnam-MH686048(indigenous)

Anaplasmaplatys-(BVHD4)-Vietnam-MH686049(indigenous)

Ehrlichiasp-(AmHc79)-Russia-JX092090

Ehrlichiasp-(EH1087)-Japan-AY309971

Ehrlichia ewingii-(Stillwater)-United States-M73227

Ehrlichia muris-(AS145)-United States-U15527

Ehrlichia chaffeensis-(Arkansas)-United States-M73222

Ehrlichia minasensis-(UFMG-EV)-Brazil-NR148800

Ehrlichia canis-(E60)-Japan-AB723709

Ehrlichia canis-(002)-Malaysia-KR920044

Ehrlichia canis-(171)-South Africa-KC479023

Ehrlichia canis-(ECANBkk07)-Thailand-EU263991

Ehrlichia canis-(ZKK21)-Turkey-KP745631

Wolbachia pipientis-(E-Ghent)-Belgium-AF179630

Rickettsia marmionii-(KB)-Australia-AY737685

Rickettsia rickettsii-(Sawtooth)-United States-U11021

Neorickettsia helminthoeca-United States-U12457

Neorickettsia helminthoeca-(Roxy1)-United States-KX462531

Neorickettsia risticii-(812)-Argentina-KX001784

Neorickettsia sennetsu-(11908)-Malaysia-M73225

Neorickettsia sennetsu-(Miyayama)-Japan-NR044746

100 95 93 98 100 46 94 72 92 63 47 99 34 98 86 66 61 98 99 0.02 Anaplasma Wolbachia Ehrlichia Rickettsia Neorickettsia