Vùng Xã Số bò theo dõi (con)
Núi cao Tản Lĩnh 221 Vân Hòa 206 Yên Bài 156 Tổng 583 Đồng Bằng Thái Hòa 119 Phú Đông 110 Phú Sơn 106 Tổng 335 Gò đồi Tòng Bạt 126 Vật Lại 110 Thụy An 116 Tổng 352
41
3.5.2. Thu thập mẫu để nghiên cứu
3.5.2.1. Thu thập mẫu ve
Mẫu ve ký sinh trên bò được thu thập theo phương pháp thường quy (Trịnh Văn Thịnh, 1963).
Kỹ thuật thu thập mẫu ve: tiến hành bắt ve trên cơ thể bò tại các vị trí yếm, nách, hai chân trước, đùi, thân… Các mẫu thu được, nhanh chóng bảo quản và đưa về phòng thí nghiệm để định loại.
Kỹ thuật bảo quản mẫu ve: đựng mẫu ve vào ống Eppendoff sau đó đổ dung dịch 1 (17 ml cồn ethanol 90%; 3 ml ete; 80ml nước cất) lắc nhẹ cho ve chết, để ở nhiệt độ thường 1-2 ngày. Đổ bỏ dung dịch 1 đi và cho vào dung dịch 2 (5 ml glyxerol; 15 ml nước cất; 80 ml cồn), bảo quản ở nhiệt độ thường (Walker & cs., 2014).
3.5.2.2. Thu thập mẫu máu bò
Thu thập mẫu máu bò theo phương pháp thường quy (Trịnh Văn Thịnh, 1963). Kỹ thuật lấy mẫu máu bò: xác định vị trí lấy máu là tĩnh mạch cổ bò, sau đó dùng bông cồn sát trùng và lấy 5 ml máu ở mỗi bò. Cho khoảng 2 ml máu vừa mới thu thập vào lọ có chứa chất ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) chống đông máu Sigma-Aldrich Co. LLC, Saint Louis, Missouri, USA), phần còn lại cho vào lọ không chứa chất đông máu và để nghiêng. Mẫu được giữ trên đá lạnh vận chuyển về phòng thí nghiệm.
- Kỹ thuật bảo quản mẫu máu: Bảo quản ở 1 - 40 C, không để quá 24 h đối với xét nghiệm Giemsa. Mẫu máu xét nghiệm PCR có thể bảo quản ở -200 C.
3.5.3. Định danh loài ve ký sinh bằng phƣơng pháp hình thái
Lựa chọn 500 mẫu ve đực trưởng thành, 500 mẫu ve cái trưởng thành. Mẫu được đưa lên phiến kính, đặt 1 tấm phản quang màu và quan sát dưới kính hiển vi soi nổi ở độ phóng đại 20- 40 lần. Xác định giống ve, dựa vào đặc điểm hình thái theo tiêu chí theo khóa phân loại của Brumpt (1919) dẫn theo Trịnh Văn Thịnh (1963).
Mô tả, so sánh với tài liệu để xác định loài ve ký sinh ở bò dựa vào khóa phân loại của Walker & cs. (2014).
Khóa định danh các giống ve cứng: A.Ve miệng dài
B.Không có mắt
C.Không có rãnh hậu môn vòng đằng trước hậu môn, con đực có mai lưng với số lượng lẻ
42 D’. Xúc biện dài có hình nón...Ceralixodes
C’. Rãnh hậu môn đằng sau hậu môn: con đực không có mai bụng....
Aponomma
B’. Có mắt
C. Con đực không có mai cạnh hậu môn... Amlplyomma
C’. Con đực có mai cạnh lỗ hậu môn với số lượng chẵn. Lỗ thở hình dấu phẩy, xúc biện gần hình trụ... Hyalomma
A’. Ve miệng ngắn
B. Có mắt hay không có mắt: mặt trên của đáy mõm hình 4 cạnh. Con đực không có mai cạnh hậu môn
C. Không có mắt. Đốt thứ 2 của các xúc biện lồi ra... Haemaphysalis
C’. Háng của cặp chân thứ 4 rất phát triển... Demacentor
B’. Có mắt; mặt trên hậu môn của đáy hậu môn hình 6 cạnh và có góc 2 bên. Con đực có mai cạnh lỗ hậu môn với số lượng chẵn.
C. Rãnh hậu môn vòng đằng sau hậu môn, lỗ thở hình dấu phẩy, xúc biện hình nón... Rhipicephalus
C’. Không có rãnh hậu môn, lỗ thở hình tròn...Boophilus
Khóa phân loại theo loài (Walker & cs., 2014)
Rãnh hậu môn vòng đằng sau hậu môn, lỗ thở hình dấu phẩy, xúc biện hình nón... Rhipicephalus
1.Loài Rhipicephalus (Boophilus) anulatus a. Hình thái cấu tạo của ve cái
- Đầu giả ngắn
- Có mắt, có mai lưng - Có mai cạnh hậu môn - Hố cảm giác hình ovan - Trụ răng dạng cột 4+4 - Giác, súc biện dài và cong - Gốc háng chân 1 không rõ - Gốc háng 2 và 3 là không có
- Vùng sau lỗ sinh dục có hình chữ U.
b. Hình thái cấu tạo của ve đực
43 - Có mắt
- Mai lưng phủ toàn phần - Gốc háng chân 1 ngắn
- Tấm mai hậu môn 3 không rõ hình đĩa - Tấm mai hậu môn 4 rõ hình đĩa
- Không có mấu đuôi.
2.Loài Rhipicephalus (Boophilus) microplus a. Hình thái cấu tạo của ve cái
- Đầu giả ngắn - Có mắt ở mai lưng - Hố cảm giác hình o van - Trụ, răng dạng cột 4+4 - Gốc xúc biện ngắn và cong.
b. Hình thái cấu tạo ve đực
- Đầu giả ngắn - Có mắt ở mai lưng - Mai lưng phủ toàn thân - Hố cảm giác hình ovan - Gốc háng chân 1 dài
- Tấm mai hậu môn 3 hình đĩa không rõ - Tấm mai hậu môn 4 rõ hình đĩa
- Có mấu đuôi.
3.Loài Rhipicephalus (Boophilus) geigyi a.Hình thái cấu tạo ve cái
- Tấm dưới miệng gồm hai hàng móc được xếp theo chiều dọc 4 + 4 - Xúc biện lồi cùng với các sợi lông nhỏ hình lược
- Đôi chân đầu tiên có các spur (mấu?) tách biệt - Đôi chân thứ 2 và thứ 3 với các spur (mấu?) - Lỗ sinh dục có hình chữ V hẹp.
b.Hình thái cấu tạo ve đực
- Đầu giả rõ ràng
44 - Tấm mai hậu môn 3 rõ ràng - Tấm mai hậu 4 rõ ràng - Mấu đuôi hẹp
- Mấu đuôi có thể nhìn rõ từ mặt lưng.
4.Loài Rhipicephalus (Boophilus) decoloratus a. Hình thái cấu tạo ve cái
- Tấm thở có hình oval hẹp
- Tấm dưới miệng gồm hai hàng móc được xếp theo chiều dọc 3 + 3
- Xúc biện lồi cùng với các sợi lông nhỏ hình lược - Đôi chân đầu tiên có các mấu rõ ràng
- Đôi chân thứ 2 và thứ 3 với các mấu - Lỗ sinh dục có hình chữ U hẹp.
b. Hình thái cấ tạo ve đực
- Đầu giả rõ ràng
- Đôi chân đầu tiên gồm các mấu ngắn - Tấm mai hậu môn rõ ràng
- Tấm mai hậu môn tách biệt - Mấu đuôi hẹp ở con đực
- Mấu đuôi có thể nhìn rõ từ mặt lưng.
3.5.4. Xác định tỷ lệ nhiễm ký sinh trùng đƣờng máu ở bò
Xác định bò ký sinh trùng đường máu bằng phương pháp nhuộm giemsa, nhận diện và xác định ký sinh trùng đường máu qua đặc điểm trên tiêu bản nhuộm bằng thuốc nhuộm giemsa (Phạm Văn Khuê & Phan Lục, 1996).
Phân biệt các loài các loài ký sinh trùng đường máu trong mẫu tiêu bản nhuộm giemsa.
c. Hồng cầu bò màu hồng nhạt, trong hồng cầu có 2 đơn bào hình quả lê liên kết với nhau tạo ra góc nhọn hoặc góc tù nhân đơn bào màu xanh lơ, nguyên sinh chất đơn bào màu hồng thẫm là Lê dạng trùng - Babesia spp.
d. Hồng cầu có những hạt hình cầu nhỏ màu xanh có nhân là Theileria spp. e. Nếu ở rìa và trong trung tâm hồng cầu có những hạt màu xanh thẫm được bao bọc bởi một vòng sáng thì đó là biên trùng – Anaplasma spp.
3.5.5. Đánh giá mối liên hệ giữa nhiễm ve và nhiễm ký sinh trùng đường máu
Xác định mối liên hệ giữa nhiễm ve và nhiễm ký sinh trùng đường máu qua phương pháp tương quan logictis R. (Nguyễn Văn Tuấn, 2020).
45
3.5.6. Định danh loài ký sinh trùng đƣờng máu bằng phƣơng pháp phân tử
Định danh loài ký sinh trùng đường máu bằng phương pháp phân tử.
Để tiến hành so sánh loài Anaplasma spp. nghiên cứu và vùng khác ở miền Bắc, Việt Nam. Trình tự tiến hành phương pháp phân tử như sau:
3.5.6.1. Tách chiết t n ố
DNA tổng số được tách chiết từ 400 L máu thu thập từ các cá thể bò có ký sinh trùng đường máu sau khi đã phát hiện bằng phương pháp nhuộm giemsa bằng bộ sinh phẩm GeneJET™ Genomic DNA Purification Kit Thermo Fisher Scientific Inc., MA, USA theo hướng dẫn của nhà sản xuất. DNA tổng số được thu trong 50 L dung dịch đệm cung cấp trong bộ kit và được bảo quản ở –20°C. Nồng độ DNA được ước tính bằng máy quang phổ GBC UV 911A GBC Scientific Equipment Pty. Ltd., Australia và được pha loãng khoảng 10 ng L để sử dụng cho PCR.
3.5.6. . ực iện ồng (nested PCR) và giải trình tự 16S rDNA của ký in trùn đường máu
Cặp mồi EHR1 5 GAACGAACGCTGGCGGCAAGC 3 và EHR2 5 AGTAYCGRACCAGATAGCCGC 3 được sử dụng cho phản ứng PCR lần 1 khuếch đại đoạn gen 16S rDNA, sau đó lấy 2 L sản phẩm PCR lần 1 làm khuôn cho PCR thứ hai, sử dụng mồi cặp EHR3 5 TGCATAGGAATCTACCTAGTAG 3´) và EHR4 (5´ CTAGGAATTCCGCTATCCTCT 3´) (Hosseini-Vasoukolaei & cs., 2014).
Mỗi một phản ứng PCR dung tích 50 L được chuẩn bị bao gồm: 3 L 10 ng L khuôn DNA tổng số đối chứng âm: 3 L H2O thay cho khuôn DNA và 25 L DreamTaq PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific Inc., MA, Hoa Kỳ , 2 L mỗi mồi 10 pmol L , 2 L dimethyl sulfoxide DMSO và 16 L H2O. PCR được tiến hành ở 94˚C trong 5 phút, tiếp theo là 35 chu kỳ [94˚C 30 giây, 52˚C 30 giây, 72˚C 2 phút , sau đó 72 ˚C 10 phút ở chu kỳ cuối cùng. Các sản phẩm PCR được nhuộm bằng ethidium bromide, kiểm tra bằng điện di trong gel agarose 1,0 trên máy soi gel Wealtec, Sparks, Nevada, USA . Sau quá trình tinh chế bằng bộ sinh phẩm tách chiết GeneJET PCR Purification kit Thermo Fisher Scientific , các sản phẩm PCR được gửi đi giải trình tự trực tiếp ở các công ty cung cấp dịch vụ thương mại Macrogen Inc., Hàn Quốc .
3.5.6.3. n t c tr n tự và t n t n ản c c di truyền
Trình tự nucleotide của Anaplasma spp. từ các mẫu ở vùng nghiên cứu thu được từ giải trình tự, được sử dụng để tìm kiếm trình tự tương đồng bằng công cụ Blast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi . Trình tự rDNA 16S đại diện của
46
Anaplasmataceaeđược thu thập từ cơ sở dữ liệu GenBank, bao gồm 34 trình tự 16S rDNA của 18 loài được sử dụng để phân tích các mối quan hệ phát sinh chủng loại và phân loại. Tất cả các trình tự 16S rDNA được căn chỉnh bằng GENEDOC 2.7. (http://iubio.bio.indiana.edu/soft/molbio/ibmpc/genedoc-readme.html).
Khoảng cách di truyền giữa các trình tự nucleotide của 16 loài chủng
Anaplasma spp. Bảng khoảng cách di truyền được tính toán sử dụng chương trình MEGA 7.0. Tổng số có 16 chuỗi 16S rDNA, trong đó có 10 chuỗi từ mẫu của Việt Nam trong nghiên cứu này và 6 trình tự tham chiếu Anaplasma bao gồm
Anaplasma marginale Trung Quốc, KU585981 và Nam Phi, AF414872 ; A. platys Đức, JQ396431 và Philippines, KP006397 ; A. bovis Australia, KY425445 và A. phagocytophilum Hàn Quốc, KT986058 .
3.5.6. . n t c t in ài và y dựn c y ả ệ
Tổng cộng có 44 trình tự nucleotide 16S rDNA, bao gồm 34 trình tự từ Ngân hàng gen và 10 trình tự Anaplasma spp. của Việt Nam được nhập vào chương trình GENEDOC 2.7 và sắp xếp căn chỉnh để phân tích phát sinh loài. Các trình tự được cắt ở cả hai đầu chuỗi để có độ dài cuối cùng là 501–502 nucleotide. Các trình tự sau đó được trích xuất từ GENEDOC 2.7 và được đưa vào MEGA7 để phân tích và xây dựng cây phát sinh loài bằng phương pháp (ML, maximum likelihood với giá trị tin cậy (bootstrap) mẫu 1000 lần mẫu lặp. Tham số mô hình thay thế với điểm số tốt nhất theo tiêu chí thông tin Bayes được chọn sử dụng đó là mô hình Jones, Taylor và Thornton F G I , với tần số ước tính từ dữ liệu F , tỷ lệ biến thiên dọc theo chiều dài của căn chỉnh G và cho phép tỷ lệ các vị trí bất biến I Kumar & cs., 2016).
Xác định đơn bào Anaplasma spp. ở bò qua so sánh trên ngân hàng gen.
3.5.7. Xác định thể bệnh, triệu chứng lâm sàng bò mắc bệnh ký sinh trùng đƣờng máu đƣờng máu
Đo thân nhiệt bò bằng nhiệt kế bách phân (Trịnh Văn Thịnh, 1963).
Xác định triệu chứng lâm sàng của bò mắc bệnh ký sinh trùng đường máu trong tự nhiên qua khám trực tiếp và thu thập thông tin chủ yếu: thân nhiệt, cơn sốt, màu nước tiểu, màu sắc niêm mạc mắt, hậu môn và thể bệnh (Trịnh Văn Thịnh, 1963).
Nghiên cứu trên 30 bò dương tính với ký sinh trùng đường máu có biểu hiện triệu chứng lâm sàng. Quan sát các triệu chứng, màu sắc niêm mạc mắt, màu sắc nước tiểu, chảy nước dãi, thần kinh, thể trạng cơ thể.
3.5.8. Xác định bệnh tích đại thể bò mắc bệnh ký sinh trùng đƣờng máu
Xác định thể bệnh dựa trên sự xuất hiện các dấu hiệu lâm sàng và bệnh tích đại thể.
47
Xác định bệnh tích đại thể bò mắc bệnh bằng phương pháp mổ khám toàn diện của Skrjabin (1944) kết hợp mổ khám được thực hiện theo quy trình mô tả của tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8420:2010 về Bệnh động vật – Quy trình mổ khám. Đánh giá sự biến đổi của các cơ quan tổ chức của bò bị bệnh. Chụp ảnh và mô tả.
Mổ khám bò bị bệnh cấp tính và chết ở huyện Ba Vì - Hà Nội kết quả xét nghiệm dương tính với Anaplasma spp. Các tổn thương được chụp ảnh. Ghi chép và mô tả.
3.5.9. Xác định bệnh tích vi thể
Xác định bệnh tích vi thể bằng phương pháp làm tiêu bản vi thể của Jones (1969).
Bệnh tích vi thể của bò mắc ký sinh trùng đường máu, mẫu bệnh phẩm là các các cơ quan nội tạng: hạch lypmpho, lách, phổi, gan... Cố định trong dung dịch formol trung tính 10%. Các mẫu sau đó được xử lý làm tiêu bản vi thể theo quy trình tẩm đúc parafftin, cắt tiêu bản độ dày 3µm, nhuộm bằng Hemotoxylin – Eosin. Các tổn thương vi thể được quan sát dưới kính hiển vi quang học.
3.5.10. Xác định chỉ tiêu sinh lý máu
Phân tích chỉ tiêu sinh lý 30 mẫu máu bò dương tính với Anaplasma spp. Mẫu được phân tích tự động trên máy huyết học Hema Screen 18 tại Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ sinh học Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
3.5.11. Phƣơng pháp thử nghiệm thuốc diệt ve ký sinh trên bò
Thử nghiệm hiệu lực của thuốc diệt ve bằng phương pháp thực nghiệm.
3.5.11.1. Thử nghiệm hiệu lực diệt ve trong phòng thí nghiệm được bố trí như sau
Hợp chất bán tổng hợp Pyrethroid dẫn xuất chính là Permethrin do viện Sốt rét- Ký sinh trùng – Côn trùng Trung Ương cung cấp. Thuốc được dựng trong lọ màu tối, thuốc tồn tại dưới dạng nhũ tương đậm đặc có màu trắng. Thử nghiệm được pha với nước thành các nồng độ 1%, 3%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, sau khi pha thuốc đươc bảo quản trong lọ thủy tinh có nắp đậy kín. Thử nghiệm thuốc ở tất cả các nồng độ với mẫu ve trưởng thành, ấu trùng, thiếu trùng thu thập từ thực địa. Số lượng ve thử nghiệm theo là 30 ấu trùng, 30 thiếu trùng, 30 trưởng thành.
Phương pháp thử nghiệm: nhúng vào dung dịch thuốc sau đưa ra để theo dõi tác dụng gây độc của thuốc qua các mốc thời gian: 24 giờ, 48 giờ. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Dùng 40 đĩa petri có đường kính 5 cm. Trong đó: 10 đĩa chứa thuốc ở nồng độ từ 1 đến 10%, mỗi đĩa chứa 20 ml thuốc. Mỗi giai đoạn của ve sau khi cho
48
tiếp xúc với thuốc được giữ trong các đĩa petri tiếp tục theo dõi tác dụng của thuốc qua các mốc thời gian.
Các giai đoạn của ve được xác định là đã chết khi không còn cử động, co thể bị teo lại sau thời gian từ 24 giờ đến 48 giờ;
Lô đối chứng: mỗi giai đoạn của ve đều bố trí lô đối chứng, dung dịch đối chứng là nước cất, PH = 7,2.
3.5.11.2. Thử nghiệm diệt ve trên cơ t ể bò bằng hóa chất Permethrin
- Trước khi thí nghiệm trên bò, tiến hành triển tra triệu chứng lâm sàng, đo nhịp tim, tần số hô hấp của bò bằng tai nghe thú y;
- Chọn 3 bò nhiễm các giai đoạn của ve với cường độ cao, đếm số lượng các giai đoạn ve ở từng bò. Kiểm tra một số chỉ tiêu lâm sàng của bò trước khi dùng hóa dược diệt ve.
- Diệt ve trên cơ thể bò theo phương pháp phun thuốc vào những vùng có ve