2.3.4.1. Nuôi cấy tế bào và đánh giá khả năng sống sót của tế bào
Tế bào BV2 được nuôi cấy trong đĩa có đường kính 100 mm chứa môi trường DMEM và RPMI bổ sung 10% (v/v) FBS bất hoạt nhiệt, penicillin G (100 đơn vị/mL), streptomycin (100 μg/mL) và L-glutamine (2 mM) với nồng độ 5 x 10⁶ tế bào/đĩa ( 5 x 10⁵ tế bào/mL) và được ủ ở 37 ° C trong môi trường làm ẩm có chứa 5% CO2. Để xác định khả năng tồn tại của tế bào, tế bào được mạ trong đĩa 96 giếng (2×104 tế bào giếng) được ủ với 3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) ở nồng độ cuối cùng là 0,5mg/mL trong 4 giờ. Muối formazan tạo thành được hòa tan trong axit hóa 2- propanol và mật độ quang của dung dịch được đo ở 590 nm bằng cách sử dụng đầu đọc vi tấm (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Các mật độ quang của formazan được hình thành trong các tế bào đối chứng (không
được xử lý) là được coi là đại diện cho khả năng tồn tại 100%. Thử nghiệm độc lập lặp lại ba lần [158].
2.3.4.2. Xác định nồng độ nitrite
Nitrite (NO₂⁻) được xem là chỉ thị cho việc tạo NO, sẽ được xác định nhờ bộ Griess Reagent System (Promega Cooperation, WI, USA). Cụ thể là, 100μL môi trường nuôi tế bào (ủ mẫu) được chuyển sang đĩa 96 mới và được thêm vào 100μL Griess reagent (50μL of 1% (w/v) sulfanilamide trong 5% (v/v) acid phosphoric và 50μL 0,1% (w/v) n-1-naphthylethylenediamine dihydrochloride pha trong nước. Hỗn hợp này được ủ tiếp ở nhiệt độ phòng trong 20 phút và hàm lượng nitrite sẽ được đo bằng máy ELISA plate reader ở bước sóng 525nm. Thí nghiệm được lặp lại ba lần để đảm bảo tính chính xác.
Nồng độ nitrite trong môi trường, một chất chỉ thị về sự tạo NO, được đo bằng phản ứng Griess. Ba thử nghiệm độc lập đã được thực hiện. Một phần của phần nổi phía trên (100 μL) được trộn với một thể tích bằng thuốc thử Griess (Dung dịch A: 222488, Dung dịch B: S438081; Sigma-Aldrich) và độ hấp thụ của hỗn hợp ở bước sóng 525nm được xác định bằng cách sử dụng một liên kết enzym máy đọc đĩa xét nghiệm hấp thụ miễn dịch (ELISA) [159].
2.3.4.3. Xác định nồng độ PGE2
Mức độ PGE2 hiện diện trong mỗi mẫu được xác định bằng cách sử dụng bộ kit Elisa có sẵn từ Hệ thống R&D (Minneapolis, MN) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Thí nghiệm được lặp lại ba lần.
Các tế bào BV2 được nuôi cấy trong các đĩa 24 giếng, ủ trước trong 3 giờ với các nồng độ hợp chất khác nhau, và sau đó được kích thích trong 24 giờ bằng LPS. Các chất nổi nuôi cấy tế bào được thu thập ngay sau khi xử lý và quay ở 13.000 × g trong 2 phút để loại bỏ các chất dạng hạt. Các môi trường đã được thêm vào đĩa 96 giếng được phủ trước bằng chất làm sạch ái lực kháng thể đa dòng đặc hiệu cho PGE2. Một đa dòng liên kết với enzyme kháng thể đặc hiệu cho PGE2 được thêm vào giếng, để phản ứng trong 24 giờ, và rửa sạch để loại bỏ bất kỳ thuốc thử kháng thể-enzym không liên kết nào.
Sau việc bổ sung dung dịch chất nền, cường độ màu được tạo ra là được đo ở bước sóng 450 nm, tỷ lệ với lượng PGE2 hiện tại [158].
2.3.4.4. Phân tích Western blot
Tế bào BV2 được thu hoạch và cô lại bằng cách ly tâm ở tốc độ 16.000 vòng/phút trong 15 phút. Các tế bào khô được rửa bằng nước muối đệm phosphat (PBS) và ly giải với đệm Tris-HCl 20 mM (pH 7.4) chứa hỗn hợp chất ức chế protease (0,1 mM PMSF, 5 mg/mL aprotinin, 5 mg/mL pepstatin A và 1 mg/mL chymostatin). Nồng độ protein được xác định bằng cách sử dụng bộ xét nghiệm protein Lowry (P5626; Sigma-Aldrich) và một lượng protein bằng nhau từ mỗi mẫu được phân giải bằng cách sử dụng điện di trên gel natri dodecyl sulfatpolyacrylamide 7,5% hoặc 12% (SDS-PAGE) và sau đó được chuyển điện di vào chất phát quang hóa học tăng cường Hybond ™ màng nitrocellulose (Bio-Rad). Màng đã bị chặn với sữa tách béo 5% (w/v) và được ủ tuần tự với kháng thể chính (Santa Cruz Biotechnology, CA, Mỹ) và kháng thể thứ cấp liên hợp peroxidase củ cải ngựa, sau đó phát hiện ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, Mỹ). Các cường độ tín hiệu băng tần đã được định lượng bằng cách sử dụng phần mềm ImageJ (Viện Y tế Quốc gia, Bethesda, MD). Các marker trọng lượng phân tử và các chất nội chuẩn, β-actin và PCNA, cũng chạy trên gel. Phân tích được lặp lại ba lần [158].
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả nhân sinh khối và tạo cao chiết tổng chủng vi nấm
Penicillium oxalicum CLC-MF05
Vi nấm biển Penicillium oxalicum CLC-MF05 được nuôi cấy trên môi trường thạch PDA chứa 3,0% muối biển trong bảy ngày. Sau đó bào tử của chủng nấm được chuyển vào 20 bình Erlenmeyer x 2000 mL, mỗi bình chứa 100 mL môi trường nuôi cấy và ủ ở 25°C trong 15 ngày. Môi trường PDA lên men và sợi bào tử nấm phát triển phủ kín bề mặt thạch. 20 bình lên men sau đó được chiết xuất ba lần bằng EtOAc để cung cấp dịch chiết hữu cơ sau đó được làm bay hơi để tạo ra dư lượng cao chiết nấm Penicillium oxalicum
CLC-MF05 (5.7 g). Phần cặn được rửa và lọc bằng metanol để tạo ra dung dịch hòa tan và phần cặn không hòa tan. Sau khi cô đặc, bằng các phương pháp phân tích hóa học cao chiết được phân tách để thu được các hợp chất thứ cấp. Sơ đồ tạo cao chiết tổng chủng vi nấm biển Penicillium oxalicum CLC- MF05 được thể hiện ở hình 3.1.
+ EtOAc Đĩa nuôi cấy P.oxalicum
CLC-MF05
Dịch chiết EtOAc 3 lần 20 bình 2L x 100ml PDA
PDA lên men
25°C, 15 ngày
Cao chiết tổng EtOAc (5.7g) Thu hồi EtOAc