Hình 3.15: Cấu trúc hóa học của hợp chất 3
Hợp chất 3 được phân lập dưới dạng bột màu vàng. Công thức phân tử của hợp chất 3 được thiết lập là C13H14O4 thông qua sự xuất hiện của tín hiệu ion giả phân tử [M+Na]+ tại m/z 257.0796 (tính toán lý thuyết cho công thức C13H14NaO4+, 257.0784), cho thấy sự có mặt của 7 liên kết đôi tương đương.
Hình 3.16: Phổ HR-ESI-TOF-MS của hợp chất 3
Phổ 1H NMR của hợp chất 3 ghi nhận tín hiệu của proton thơm đặc trưng ở vị trí meta với nhau tại H 6.63 (d, J = 2.4 Hz, H-6) và 6.66 (d, J = 2.4 Hz, H-8) gợi ý sự có mặt của một vòng benzene thế ở 4 vị trí 1,2,3,5 (Bảng 3.3). Ngoài ra, tín hiệu của một proton olefin tại H 6.06 (s, H-3), một nhóm methylene tại H 2.69 (dd, J = 7.6, 12.8 Hz, Ha-1) và 2.65 (dd, J = 7.6, 12.4 Hz, Hb-1), một nhóm oxymethine tại H 4.19 (m, H-2), và 2 nhóm methyl tại
H 1.27 (d, J = 6.0 Hz, H3-3) và 2.71 (s, 2-CH3) cũng được ghi nhận trên phổ
1H NMR của hợp chất 3.
Trên phổ 13C NMR của hợp chất 3 ghi nhận tín hiệu của 13 cacbon,
trong đó có một cacbon cacbonyl tại C 182.0 (C-4), 6 cacbon của vòng thơm [trong đó có 4 cacbon không liên kết với proton tại C 167.1 (C-5), 143.7 (C- 7), 163.1 (C-9), và 115.9 (C-10)], một liên kết đôi thế ba vị trí tại C 161.5 (C- 2) và 118.0 (C-3), cùng với các tín hiệu đặc trưng của một nhánh 1-propyl-2- ol tại C 44.2 (C-1), 66.4 (C-2) và 23.1 (C-3) (Bảng 3.3).
Hình 3.18: Phổ 13C NMR (100 MHz, CD3OD) của hợp chất 3
Các dữ kiện phổ này cho gợi ý hợp chất 3 có dạng khung chromone,
dạng khung cũng được phát hiện phổ biến ở vi nấm biển. Theo đó, tiến hành so sánh số liệu phổ của hợp chất 3 với một hợp chất chromone đã biết cho kết quả hoàn toàn tương đồng [161] (Bảng 3.3). Điều này cũng phù hợp với các dữ kiện phổ khối lượng phân giải cao và số liên kết đôi tương đương. Trên cơ sở các phân tích phổ và so sánh với tài liệu tham khảo, cấu trúc hóa học của hợp chất 3 được xác định là 5-hydroxy-7-(2'-hydroxypropyl)-2-methyl-
Bảng 3.3: Số liệu phổ 1H và 13C NMR của hợp chất 3
Vị trí C# Ca,b Ha,c (dạng peak, J = Hz)
2 161.6 161.5 3 118.1 118.0 6.06 (s) 4 182.1 182.0 5 167.2 167.1 6 112.6 112.5 6.63 (d, 2.4) 7 143.8 143.7 8 101.8 101.7 6.66 (d, 2.4) 9 163.1 163.1 10 116.0 115.9 1 44.3 44.2 2.69 (dd, 7.6, 12.8) 2.65 (dd, 7.6, 12.4) 2 66.5 66.4 4.19 (m) 3 23.2 23.1 1.27 (d, 6.0) 2-CH3 23.6 23.5 2.71 (s)
# Ccủa 5-hydroxy-7-(2'-hydroxypropyl)-2-methyl-chromone đo trong CD3OD [161], a CD3OD, b 100 MHz, c 400 MHz
Như vậy, bằng các phân tích quang phổ cấu trúc hoá học của 3 hợp chất phân lập được từ P. oxalicum CLC-MF05 đã xác định như ở hình 3.19.
Hình 3.19: Cấu trúc hoá học của hợp chất 1-3 từ P. oxalicum CLC-MF05 3.4. Kết quả hoạt tính kháng viêm của hợp chất
3.4.1. Ảnh hưởng của hợp chất 1-3 đến khả năng sống sót của tế bào BV2
Hoạt tính kháng viêm của các hợp chất phân lập được từ vi nấm biển
Penicillium oxalicum CLC-MF05 được đánh giá thông qua khả năng ức chế sự sinh sản NO và PGE2 trong tế bào BV2 được kích thích bởi LPS được thực hiện như mục 2.3.4.2. và 2.3.4.3. Trước khi thử khả năng ức chế sản sinh NO và PGE trên tế bào BV2, các hợp chất 1-3 được đánh giá ảnh hưởng đến sự
phát triển của tế bào BV2 ở các nồng độ thử nghiệm (5,0 đến 160,0M). Việc đánh giá độc tính tế bào của các hợp chất 1-3 bằng xét nghiệm MTT được
thực hiện để loại trừ xác suất mà hoạt tính chống viêm thần kinh của các hợp chất 1-3 bắt nguồn từ độc tính tế bào của chúng.
Kết quả đánh giá sự ảnh hưở ng của 3 hợp chất 1-3 đến sự phát triển
của tế bào BV2 ở các nồng độ thử nghiệm cho thấy ở các nồng độ 5,0M, 10M và 20M của hợp chất 1 và 2 và các nồng độ 20M, 40M và 80M của hợp chất 3, các hợp chất này không ảnh hưở ng đến sự phát triển bình thường của tế bào BV2 (phần trăm tế bào sống sót nằm trong giới hạn 90%- 110% so với mẫu chuẩn không chứa chất thử nghiệm) (Hình 3.20). Tuy nhiên ở nồng độ cao nhất của cả 3 hợp chất, tỷ lệ sống sót của tế bào BV2 đều bị giảm xuống còn xấp xỉ 80%. Do đó, lượng NO sản sinh trong môi trường nuôi cấy được coi như không bi ̣ ảnh hưở ng bởi sự phát triển quá mức hay sự chết đi của tế bào trong điều kiện thí nghiệm có mặt các hợp chất 1-3. Vì thế
ở các thí nghiệm sau, các tế bào được tiếp tục xử lý ở các nồng độ còn lại trừ nồng độ cao nhất.
Hình 3.20: Ảnh hưởng của hợp chất 1-3 đến khả năng sống sót của tế bào BV2
3.4.2. Ảnh hưởng của hợp chất 1-3 đến việc sản xuất NO và PGE2 do LPS gây ra trong tế bào BV2 gây ra trong tế bào BV2
Tế bào BV2 là dòng tế bào thần kinh đệm của chuột, được xem là một mô hình quan trọng cho các thử nghiệm in vitro của các tác nhân kháng viêm ngày nay. Khi các tế bào thần kinh đệm được kích hoạt bởi LPS, một số cytokine được giải phóng và tham gia vào phản ứng viêm của cơ thể. Trong số đó, NO là một chất trung gian gây viêm, NO do iNOS tạo ra sẽ gây độc cho tế bào và liên quan trực tiếp đến cơ chế bệnh sinh của quá trình viêm. COX-1 và COX-2 là các isozyme chuyển đổi axit arachidonic thành prostaglandin, tuy nhiên, COX-2 phản ứng chủ yếu để tạo ra một lượng lớn PGE2 trong tế bào đại thực bào [162]. Do đó, việc ức chế các sản phẩm trung gian gây viêm như NO và PGE2 có thể là phương pháp hiệu quả để điều trị một số loại viêm.
Trên cơ sở đó, khả năng kháng viêm in vitro của các hợp chất 1-3 đã
được đánh giá trước tiên trên mô hình tác dụng ức chế của chúng đối với sự sản sinh quá mức NO và PGE2 ở tế bào BV2 do LPS gây ra. Các tế bào được xử lý với các hợp chất 1-3 trong 3 giờ, sau đó kích hoạt với LPS trong 24 giờ ở nồng độ 1,0 μg / mL. Nồng độ NO được đo trong dịch nuôi cấy bằng phản ứng Griess và xét nghiệm ELISA.
Như được hiển thị trong Hình 3.21, nồng độ NO trong dịch tế bào đã tăng lên rõ rệt sau khi xử lý các tế bào chỉ với LPS so với đối chứng âm. Tuy nhiên, khi các tế bào kích thích bởi LPS được xử lý với các hợp chất 1-3, chất trung gian gây viêm NO bị ức chế đáng kể theo cách phụ thuộc vào liều lượng. Đặc biệt ở nồng độ cao nhất (20M), hợp chất 1 ức chế sự sản sinh NO khoảng 3 lần so với nhóm tế bào được kích thích bởi LPS. Ở nồng độ cao nhất của hợp chất 2 (20 M) và hợp chất 3 (80 M), lượng NO sản sinh ra thấp hơn khoảng 2 lần so với nhóm tế bào được kích thích bởi LPS.
Hình 3.21: Ảnh hưởng của hợp chất 1-3 đến sự sản xuất quá mức NO ở tế bào BV2 được kích thích bởi LPS
Tương tự, kết quả đánh giá ảnh hưởng của các hợp chất 1-3 đến sự sản sinh PGE2 ở tế bào BV2 kích thích bởi LPS cho thấy nồng độ PGE2 đã tăng lên đáng kể ở nhóm tế bào được kích thích bởi LPS. Tuy nhiên, lượng PGE2
sản sinh bị ức chế mạnh khi có mặt các hợp chất 1-3 ở các nồng độ khác
nhau. Đáng chú ý, ở liều cao nhất (20M), hợp chất 1 và 2 thể hiện khả năng
ức chế lượng PGE2 sản sinh ít hơn 3 lần so với nhóm tế bào kích thích bởi LPS nhưng không được xử lý với hợp chất. Ở nồng độ cao nhất của hợp chất
3 (80M), lượng PGE2 sản sinh bị ức chế ở mức khoảng 2 lần so với nhóm tế bào kích thích bởi LPS (Hình 3.22).
Hình 3.22: Ảnh hưởng của hợp chất 1-3 đến sự sản xuất quá mức PGE2 ở tế bào BV2 được kích thích bởi LPS
Trên cơ sở các kết quả đánh giá sơ bộ tác dụng ức chế sự sản sinh NO và PGE2 của 3 hợp chất ở các nồng độ khác nhau ở tế bào BV2 kích thích bởi LPS, các hợp chất đều cho thấy khả năng ức chế có ý nghĩa sự sản sinh NO và PGE2 ở tế bào BV2. Do đó, các hợp chất này tiếp tục được thử nghiệm ở các nồng độ khác nhau để xác định giá trị ức chế 50% (IC50).
Bảng 3.4: Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh NO và PGE2 của hợp chất 1-3 Hợp chất IC50 (M) NO PGE2 1 9.2 ± 0.5 8.9 ± 0.4 2 15.2 ± 0.8 9.6 ± 0.5 3 75.5 ± 3.8 48.4 ± 2.4
Như kết quả trình bày ở Bảng 3.4, trong số 3 hợp chất thử nghiệm, hợp chất 1 thể hiện tác dụng ức chế sản sinh NO và PGE2 mạnh nhất, với giá trị IC50 9.2 ± 0.5µM và 8.9 ± 0.4 µM. Hợp chất 2 thể hiện tác dụng ức chế sản sinh NO và PGE2 rất đáng kể, với giá trị IC50 lần lượt là 15.2 ± 0.8µM và 9.6 ± 0.5 µM; trong khi hợp chất 3 thể hiện tác dụng ức chế sản sinh NO và PGE2
ở tế bào BV2 khiêm tốn nhất, với giá trị IC50 lần lượt là 75.5 ± 3.8 µM và 48.4 ± 2.4 µM. Kết quả này cũng cho thấy sự tương đồng với các thông số ức chế của các hợp chất trong thử nghiệm khảo sát ban đầu.
Như vậy cả ba hợp chất 1-3 đều thể hiện hoạt tính kháng viêm với giá
trị IC50 trong khoảng 8,9-75,5 µM. Đáng chú ý, đây là nghiên cứu đầu tiên về hoạt tính kháng viêm in vitro của các hợp chất này ở dòng tế bào BV2 kích thích bởi LPS. Nghiên cứu này có thể được sử dụng làm tiền đề cho những nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính kháng viêm của các hợp chất 1-3.
3.4.3. Ảnh hưởng của hợp chất 1-3 đến biểu hiện protein iNOS và COX-2
NO và PGE2 là chất trung gian gây viêm được tạo ra bởi các enzym cảm ứng tương ứng của chúng là iNOS và COX-2 [3]. Những chất trung gian này đóng vai trò quan trọng trong việc kích hoạt các đại thực bào trong quá trình phản ứng viêm. Do đó, việc ức chế sản xuất NO và PGE2 bằng cách ức chế biểu hiện protein iNOS và COX-2 được coi là một trong những phương pháp điều trị đối với các bệnh viêm nhiễm [6,7]. Trên cơ sở đó, ảnh hưởng của các hợp chất 1-3 đối với sự biểu hiện của protein iNOS và COX-2 trong tế bào BV2 được đánh giá bằng phương pháp phân tích Western blot. Kết quả cho thấy, các protein iNOS và COX-2 được biểu hiện tăng lên đáng kể ở nhóm các tế bào kích thích bởi LPS (1.0μg/mL). Tuy nhiên, khi được điều trị với các hợp chất, sự biểu hiện của iNOS và COX-2 do LPS gây ra đã bị ức chế theo cách phụ thuộc vào nồng độ. Những kết quả này cho thấy các hợp chất 1-3 ức chế sự sản sinh các chất trung gian gây viêm như NO và PGE2
thông qua việc ngăn chặn sự biểu hiện của iNOS và COX-2 trong các tế bào BV2 được kích thích bởi LPS. Bên cạnh đó, sự biểu hiện của protein β-actin không thay đổi đáng kể khi có sự hiện diện của cả 3 hợp chất 1-3. Những kết quả này cho thấy rằng các hợp chất 1-3 thể hiện tác dụng kháng viêm thần
Hình 3.23: Ảnh hưởng của 1-3 đối với sự biểu hiện quá mức của iNOS và COX-2 do LPS gây ra ở tế bào BV2
Mức iNOS và COX-2 được đánh giá bằng phân tích Western blot (n = 3). β-Actin là chất nội chuẩn. ** p <0,01 và *** p <0,001 so với nhóm chỉ sử dụng LPS.
NO đóng một vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh hệ thống mạch máu và miễn dịch. Nó đã được chứng minh là một phân tử tín hiệu quan trọng liên quan đến việc điều chỉnh một loạt các hoạt động sinh học trong hệ thống mạch máu, thần kinh và miễn dịch [163]. Tuy nhiên, sản xuất quá nhiều NO từ các tế bào viêm được phát hiện là nguyên nhân gây ra sinh lý bệnh trong nhiều loại bệnh, sinh ung thư và viêm. NO được hình thành từ L-arginine bởi NO synthase (NOS), được tạo ra bởi nhiều loại tế bào. Ba dạng đồng dạng riêng biệt của NOS đã được xác định, bao gồm NOS nội mô cấu tạo (eNOS), NOS tế bào thần kinh (nNOS) và NOS cảm ứng (iNOS) [7]. Trong các đại thực bào, iNOS được tạo ra đáng kể bởi sự kích thích của LPS. PGE2 được coi là một trong những chất trung gian gây viêm mạnh nhất trong phản ứng viêm. Nó được chuyển hóa từ axit arachidonic thông qua phản ứng xúc tác COX-2. Hoạt động của enzyme COX-2 xúc tác bước đầu tiên trong quá trình tổng hợp prostaglandin [164]. Sự ức chế iNOS, enzym trung gian sản xuất NO, đã được chứng minh là có thể ngăn chặn sự giải phóng prostaglandin trong các tế bào thần kinh đệm BV2. COX-2 cũng có thể bị ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt động enzym của nó bởi NO và iNOS. Các kết quả cho thấy các hợp chất 1-3 thể hiện khả năng ức chế đáng kể sự sản sinh NO và PGE2 do
LPS gây ra theo cách phụ thuộc vào nồng độ ở các tế bào BV2. Sự biểu hiện của iNOS và COX-2 cũng bị kìm hãm đáng kể bởi hợp chất 1 và 2 ở nồng độ lần lượt là 10 μM và 20 μM và hợp chất 3 ở nồng độ lần lượt là 40 μM và 80 μM. Tuy nhiên, các hợp chất chỉ thể hiện tác dụng ức chế ở mức yếu đối với sự biểu hiện của COX-2 ở nồng độ thấp nhất. Kết quả của nghiên cứu này đã cho thấy các hợp chất 1-3 có thể được xem như các hợp chất dẫn đường đầy
hứa hẹn cho các nghiên cứu tiếp theo để phát triển các yếu tố kháng viêm, góp phần ngăn ngừa và điều trị các bệnh viêm nhiễm.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
- Đã lên men nhân sinh khối lượng lớn và thu được 5.7g cao chiết tổng của chủng vi nấm biển Penicillium oxalicum CLC-MF05.
- Đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 3 hợp chất từ cao chiết tổng của chủng Penicillium oxalicum CLC-MF05, bao gồm: oxaline (1),
isorhodoptilometrin (2) và 5-hydroxy-7- (2-hydroxypropyl) -2-metyl- chromone (3).
- Đã đánh giá hoạt tính kháng viêm của các hợp chất phân lập được. Kết quả cho thấy cả 3 hợp chất đều có tác dụng ức chế sự sản sinh NO và PGE2 ở tế bào BV2 được kích thích bởi LPS, với giá trị IC50 trong khoảng từ 9,2- 75,5µM và 8,9-48,9µM tương ứng. Ngoài ra các hợp chất đều thể hiện hoạt tính ức chế biểu hiện iNOS và COX-2 theo cách phụ thuộc vào nồng độ .
Kiến nghị
Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về cơ chế hoạt động ở cấp độ phân tử của các hợp chất, bao gồm các con đường truyền tín hiệu NF-B, MAPK hay TLR4/MyD88 ở dòng tế bào BV2.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Gilmore T.D., 1999, The Rel/NF-κB signal transduction pathway: Introduction, Oncogene, 18, pp 6842–6844.
2. Dray A., 1995, Inflammatory mediators of pain, Br. J. Anaesth, 75, pp 125–131.
3. Vo T., Ngo D., Kim S., 2012, Potential targets for anti-inflammatory and anti-allergic activities of marine algae: an overview, Inflamm. Allergy— Drug Targets, 11, pp 90–101.
4. Hotamisligil G.S, 2005, Inflammation and metabolic disorders, Nature, 444, pp 860-867.
5. Medzhitov R., 2008, Origin and physiological roles of inflammation,
Nature, 454, pp 428-435.
6. Niu X., Wang Y., Li W., Zhang H., Wang X., Mu Q., He Z., Yao H., 2015, Esculin exhibited anti-inflammatory activities in vivo and regulated TNF-α and IL-6 production in LPS-stimulated mouse peritoneal macrophages in vitro through MAPK pathway, Int. Immunopharmacol, 29, pp 779–786. 7. Sharma J.N., Omran A.Al., Parvathy S.S., 2007, Role of nitric oxide in