CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.2. Phân lập và làm thuần
- Chuẩn bị môi trường PDA được hấp khử trùng 121oC/ 1atm/ 20phút. Đổ môi trường 1/3 đĩa petri đã hấp khử trùng để nguội [25]. Các thao tác được thực hiện trong điều kiện vô trùng.
+ Mẫu được khử trùng bằng cồn 70o.
+ Cắt mẫu bệnh thành những đoạn nhỏ có kích thước 3 – 5mm sau đó ủ trên môi trường PDA để hạn chế nhiễm khuẩn. Ủ 28oC/ 5-7 ngày.
+ Dùng dao cấy cắt một miếng thạch có sợi nấm cấy truyền sang đĩa mới để làm thuần.
+ Cấy lặp lại đến khi đĩa môi trường chứa khuẩn lạc đặc trưng sau 5-7 ngày ủ.
- Bảo quản giống trên ống thạch nghiêng [25].
+ Chuẩn bị ống thạch nghiêng chứa môi trường PDA được hấp khử trùng . + Dùng dao cấy cắt mẫu thạch chứa sợi nấm từ đĩa nấm đã thuần sang ống thạch nghiêng có chứa môi trường PDA.
+ Đậy nút bông, quấn parafin, ghi chú tên mẫu và ngày cấy giữ giống. + Bảo quản mẫu ở ngăn mát tủ lạnh 4oC
- Bảo quản nấm sợi bằng phương pháp lạnh sâu -80oC [25] + Chuẩn bị tế bào cho lạnh sâu.
+ Pha dịch tế bào với glycerol (chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh để không làm tế bào bị vỡ) đã thanh trùng trước để đạt nồng độ cuối cùng là 10% và mật độ tế bào là 106.
+ Dịch huyền phù tế bào được đưa vào ống lạnh sâu và đóng nắp, để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để cân bằng áp suất.
+ Hoạt hóa mẫu: Mẫu được hoạt hóa bằng cách làm tan nhanh tới mức có thể (tủ ấm 37oC trong 40 – 60 giây). Tế bào có khả năng sống khoảng 95% sau 10 năm.