4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn đề tài
2.3.4.Định danh nấm bằng phương pháp phân tích hình thái học và bằng phương pháp
bằng phương pháp giải trình tự vùng gen ITS
2.3.4.1. Phương pháp định danh bằng hình thái học
- Phương pháp phòng ẩm dùng để nghiên cứu sự sắp xếp của tế bào một cách tự nhiên trong khuẩn lạc như hình dạng cuống sinh bào tử, chuỗi bào tử của nấm. Bào tử của nấm khi sinh trưởng sẽ lan sang mép lame.
- Chuẩn bị dụng cụ: Lame, lamelle, đĩa petri có lót giấy lọc, thanh thủy tinh chữ U, môi trường PDA. Hấp khử trùng 121oC/ 1atm/ 20phút.
+ Dùng micropippet hút môi trường và nhỏ vào lame được đặt trong đĩa petri có chứa giấy lọc sao cho môi trường trang mỏng 2/3 lame, để môi trường đông tự nhiên.
+ Dùng que cấy vòng ria tế bào nấm lên lame, đậy lamelle lại.
+ Nhỏ nước cất vô trùng sao cho thấm đều giấy lọc, đậy nắp đĩa petri lại, quấn parafin. Ủ ở nhiệt độ phòng từ 3-5 ngày.
+ Quan sát bảo tử nấm dưới kính hiển vi quang học.
2.3.4.2. Phương pháp định danh bằng trình tự ITS
❖ Ly trích DNA theo phương pháp CTAB [26], [27], [29]
Chuẩn bị mẫu
- Mẫu nấm được nuôi tăng sinh trên môi trường PDA lỏng. Tăng sinh đến khi có bào tử nấm.
Phá màng tế bào
+ Bước 1: Cho dịch nấm đã tăng sinh vào ống eppendorf, thêm 1 ml nước cất vô trùng vào, ly tâm 10.000rpm/ 15phút
+ Bước 2: Sau khi ly tâm, thu bỏ dịch, thêm 800µl CTAB buffer, vortex mạnh. Ủ 60oC/ 60 phút.
+ Bước 3: Ly tâm 13.000rpm/ 15phút, thu dịch (600µl) vào eppendorf mới, bỏ tủa.
Loại bỏ Protein
+ Bước 4: Thêm 600µl (P:C:I)(25:24:1) vào mix lạnh 2 phút, ly tâm lạnh 14.000 rpm/ 10 phút/ 4oC.
+ Bước 5: Sau khi ly tâm thì hỗn hợp tác thành 3 lớp, nhẹ nhàng hút phân lớp nước (phân lớp trên cùng) cho vào eppendorf mới.
Tủa DNA
+ Bước 6: Tủa DNA bằng Isoprophenol tỷ lệ 1:1. Ủ ở -20oC/ 30 phút. + Bước 7: Ly tâm 14.000rpm/ 15phút/ 4oC. Thu tủa màu trắng đục.
+ Bước 8: Cho 1ml Ethanol 70% vào trộn nhẹ nhàng và ly tâm ở 14.000rpm/ 15phút/ 4oC. Loại hết dịch nổi và làm bay hơi hết Ethanol trong Eppendorf.
+ Bước 9: Cho 50µl nước (nuclease free) trộn đều DNA và bảo quản ở -20oC.
❖ Điện di kiểm tra sự có mặt của DNA
Nguyên tắc
- Các phân tử nucleic acid có khối lượng và điện tích khác nhau được tách ra khi di chuyển từ cực âm sang cực dương của hệ điện di trong một điện trường có điện thế và cường độ thích hợp. Tốc độ dịch chuyển của các phân tử trong gel phụ thuộc vào kích thước, cấu hình phân tử, nồng độ gel, lực điện trường,... Điện di gel agarose được xem là phương pháp tối ưu nhất dùng để phân tích, xác định và tinh sạch các đoạn DNA. Vị trí của DNA trong gel được xác định trực tiếp: phát hiện DNA bằng Gel Red có trong Loading buffer và quan sát dưới tử ngoại (UV) [26], [27].
Các bước thực hiện
- Định tính DNA của nấm sau khi ly trích bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose 1% theo các bước sau:
- Chuẩn bị gel agarose bằng cách: Cân 1g agarose cho vào 100ml TAE 1X, lắc nhẹ cho agarose phân tán đều, đun nóng trong lò vi sóng ở 650W trong 2 phút. Để nhiệt độ trong chai giảm xuống dần, đổ vào khuôn có gắn lược với số giếng mong muốn. Chờ gel đông (30 phút), lấy lược ra và bắt đầu tiến hành nạp mẫu [27].
- Nạp mẫu, điện di và đọc kết quả: Dùng micropipette hút lấy 5µl mẫu, trộn đều với 2µl loading buffer 6X, hút tổng lượng thể tích là 6µl bơm vào giếng tương ứng đã bố trí sẵn. Lần lượt bơm các mẫu khác đã được trộn đều với thuốc nhuộm vào tất cả các giếng còn lại. Tiến hành điện di trên gel agarose 1% trong dung
dịch đệm TAE 1X, hiệu điện thế là 90V, cường độ dòng điện 400mA trong 30 phút. Kết thúc quá trình điện di đọc kết quả dưới hộp đèn UV [27]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
❖ Thực hiện phản ứng PCR
Khuếch đại gen ITS bằng kĩ thuật PCR
Đoạn gen ITS được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu ITS1F/ITS4 được thực hiện trên máy PCR Techne TC-512. Phương pháp PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase. Khi có sự hiện diện của hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA trong phản ứng PCR và ở điều kiện đảm bảo hoạt động của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai mồi sẽ được khuếch đại tạo nên số lượng lớn các bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và điện di trên gel agarose. - Thành phần phản ứng PCR 25 µl + MyTaq Mix 2X 12,5 µl + Nước MiliQ 9,5 µl + Mồi xuôi (Fw) nồng độ 0,4 µM 1 µl + Mồi ngược (Rv) nồng độ 0,4 µM 1 µl + Mẫu DNA 1 µl
Chu kì nhiệt của phản ứng PCR - Giai đoạn 1: 95oC trong 3 phút - Giai đoạn 2:
+ Bước 1: 95oC trong 30 giây + Bước 2: 53oC trong 45 giây + Bước 3: 72oC trong 45 giây Lặp lại 30 chu kỳ
Tinh sạch sản phẩm PCR
- Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng Kit GenJET PCR Purification.
Phân tích số liệu
- Các trình tự ITS thu được của mẫu nghiên cứu được so sánh với trình tự trong ngân hàng gen bằng công cụ tìm kiếm BLAST.
Giải trình tự gen và định danh
Sản phẩm đã PCR được gửi để giải trình tự DNA tại công ty TNHH Phát triển Công nghệ ứng dụng Việt Nam (VNDAT).
Kết quả sẽ được gửi về và được xử lý bằng các phần mềm DNAStar Lasergene 14.0 và Ngân hàng gen http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ để định danh đến loài và xây dựng cây phát sinh loài.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. THU MẪU
Mẫu được thu thập từ đồng ruộng ở 2 tỉnh An Giang và Kiên Giang, vào tháng 2 năm 2019. Các mẫu được thu thập tập trung vào nhóm bệnh cháy lá và đạo ôn.
3.1.1. Thu mẫu tại tỉnh An Giang
Dựa vào các triệu chứng bệnh đặc trưng ở lúa, kết quả thu được 40 mẫu bệnh thuộc các giống lúa Jasmine, Nàng hoa, OM5451, IR50404, 696, RVT, OM4900 (Phụ lục 1, Bảng 1). Nấm gây ra bệnh ở tất cả các giai đoạn phát triển của cây lúa. Trên lá lúa dễ bị bệnh, vết bệnh ban đầu xuất hiện như là các chấm màu xám hoặc nâu, nâu vàng dọc theo rìa lá. Sau đó, chúng biến thành các đốm hình elip dài và có hình thoi với đầu nhọn, những đốm này trở nên hoại tử, ở giữa có màu nâu hoặc nâu đỏ. Những chỗ này lan ra và hình thành các vết thương lớn hơn. Trên thân, nấm tạo ra các vết thương dài, xám đến đen. Bệnh cũng xuất hiện trên các hạt giống lúa như dạng hình thoi màu nâu (Hình 3.1).
Hình 3.1. Mẫu lá lúa bị nhiễm bệnh thu được tại tỉnh An Giang
3.1.2. Thu mẫu tại tỉnh Kiên Giang
Từ các triệu chứng bệnh đặc trưng ở lúa, thu nhận được 100 mẫu bệnh thuộc các giống lúa Jasmine, Đài thơm, OM5451, Lài thơm, Long Hồ 8, NPT,
OM4900, TBJ3 (Phụ lục 1, Bảng 2). Vết bệnh chỉ nhỏ như đầu mũi kim, màu xám xanh giống như bị nước sôi, sau đó chuyển sang màu nâu, rồi lan rộng dần ra thành hình thoi, xung quanh màu nâu đậm, giữa màu xám trắng (Hình 3.2)
Hình 3.2. Mẫu lá lúa bị nhiễm bệnh thu được tại tỉnh Kiên Giang
3.2. PHÂN LẬP, LÀM THUẦN VÀ QUAN SÁT HÌNH THÁI
Các mẫu lá, thân, hạt, cổ bông, bông lúa bị bệnh được thu nhận tại hai tỉnh An Giang và Kiên Giang được phân lập trên môi trường PDA.
3.2.1. Phân lập, làm thuần và quan sát hình thái ở tỉnh An Giang
Tại tỉnh An Giang thu nhận được 40 mẫu lúa có dấu hiệu nhiễm nấm bệnh. Các mẫu lúa bệnh gồm có: mẫu lá bệnh, mẫu thân bệnh, cổ bông bệnh, bông lúa bệnh. Sau quá trình phân lập, 123 chủng nấm được làm thuần và sau đó tiến hành quan sát hình thái, ghi nhận được 7 nhóm nấm có hình thái giống nhau và dựa vào phân loại nấm mốc ở Việt Nam của tác giả Đặng Vũ Hồng Miên năm 2015 [28] và chọn một chủng nấm đại diện được thể hiện cụ thể ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả phân lập làm thuần mẫu ở tỉnh An Giang
Nhóm 1 13 AG 1.1.1; AG 1.1.2; AG 1.3.3; AG 3.2.2; AG 5.3.2; AG 7.1.5; AG 11.4.1; AG 13.1.5; AG 13.1.8.1; AG 4.1.3; AG 4.1.4; AG 4.1.6; AG 6.2.2 AG 4.1.3 Nhóm 2 14 AG 1.4.1.1; AG 4.1.1; AG 4.1.2; AG 6.1.4; AG 6.1.5; AG 6.4.2; AG 7.1.3; AG 7.1.4; AG 7.1.6; AG 9.1.3; AG 9.1.4; AG 12.1.4; AG 13.1.6; AG 13.1.7 AG 6.1.4 Nhóm 3 18 AG 1.3.2; AG 2.2.1; AG 2.2.2; AG 3.4.2; AG 6.4.3; AG 8.1.4; AG 10.3.1; AG 13.1.2; AG 2.3.1; AG 5.1.5; AG 6.3.1; AG 6.3.2; AG 12.2.1; AG 2.4.5; AG 6.1.3; AG 10.4.1; AG 10.4.2; AG 10.4.3 AG 3.4.2 Nhóm 4 28 AG 1.4.2; AG 3.4.3; AG 5.4.3; AG 8.1.3; AG 10.3.3; AG 11.4.2; AG 12.3.1; AG 13.1.1; AG1.3.1; AG 4.1.5.1; AG 4.1.5.2; AG 4.1.8; AG 9.1.8; AG 2.1.1; AG 2.1.2; AG 2.1.3; AG 2.3.2; AG 2.4.4; AG 3.1.3.2; AG 3.4.1; AG 5.2.1; AG 5.3.1; AG 5.4.1; A`G 8.1.1; AG 8.2.2; AG 5.1.3; AG 6.2.1; AG 12.4.4; AG 10.1.4; AG 11.4.3; AG 11.4.4 AG 10.3.3
Nhóm 5 15 AG 2.4.3; AG 3.1.3.1; AG 3..2.1; AG 11.1.1; AG 11.1.2; AG 13.1.8.2; AG 8.3.1; AG 8.4.3; AG 9.1.2; AG 11.1.4; AG 11.2.1; AG 11.3.2; AG 12.1.2; AG 12.1.3; AG 12.3.2 AG 3.1.3.1 Nhóm 6 30 AG 3.1.1; AG 3.3.1; AG 5.1.4; AG 5.1.1; AG 5.4.2; AG 6.1.4; AG 8.2.1; AG 8.4.1; AG 8.4.2; AG 10.1.3; AG 10.3.4; AG 10.4.4; AG 11.1.3; AG 11.3.1; AG 2.4.2; AG 5.2.2; AG 7.1.1; AG 10.3.2; AG 3.1.2; AG 4.1.7; AG 8.3.2; AG 10.1.2; AG 12.1.1; AG 12.4.2; AG 13.1.3; AG 13.1.4; AG 7.1.2; AG 8.1.2; AG 8.4.4; AG 9.1.6 AG 3.3.1 Nhóm 7 5 AG 3.3.2; AG 5.1.2; AG 6.1.1; AG 10.1.1.1; AG 12.2.2 AG 5.1.2
❖ Đặc điểm quan sát hình thái
➢ Nhóm 1, mẫu đại diện AG 4.1.3 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.3. Hình thái nấm trên môi trường PDA và hình thái bào tử mẫu (a: mặt trên, b: mặt dưới, c: hình thái bào tử)
Khuẩn lạc được nuôi cấy trên môi trường PDA, nhiệt độ 25oC, tuổi nấm phân loại 7 ngày, tốc độ mọc nhanh, dạng nhung mịn, mặt dưới không màu, nằm sát môi trường thạch, không tiết sắc tố (Hình 3.3a,b). Cơ quan sinh sản: Giá bào tử trần mang cuống thể bình và màu trong đục, bào tử hình cầu, có màu xanh lục (Hình 3.3c). Dựa vào các đặc điểm hình thái được mô tả cho thấy chủng nấm AG 4.1.3 có khả năng thuộc họ nấm Penicillium sp. [28].
➢ Nhóm 2, mẫu đại diện AG 6.1.4
Hình 3.4. Hình thái nấm trên môi trường PDA và hình thái bào tử mẫu (a: mặt trên, b: mặt dưới, c: hình thái bào tử)
Khuẩn lạc được nuôi cấy trên môi trường PDA, nhiệt độ 25oC, ánh sáng thường, tuổi phân loại 5 ngày, tốc độ mọc chậm, dạng nhung mịn, tâm hơi nhô cao tạo các vong tròn, ngoài cùng là sợi nấm mọc thành cụm theo nhiều hướng; mặt trên có màu vàng, phía đáy có màu đen, tơi xốp và có màu vàng nhạt (Hình 3.4a,b). Cơ quan sinh sản: Trên sợi nấm có nhiều chỗ phình. Cơ quan sinh sản phân nhánh ít, sinh sản ở đầu cuống chiếm đa số; bào tử dạng thẳng hình bầu dục có 1 đến 3 vách ngăn (Hình 3.4c). Chủng nấm AG 6.1.4 có khả năng thuộc họ nấm gây bệnh đốm nâu Curvularia sp. [28].
➢ Nhóm 3, mẫu đại diện AG 3.4.2
Hình 3.5. Hình thái nấm trên môi trường PDA và hình thái bào tử mẫu (a: mặt trên, b: mặt dưới, c: hình thái bào tử)
Khuẩn lạc được nuôi cấy trên môi trường PDA, nhiệt độ 25oC, ánh sáng thường, tuổi phân loại 5 ngày, tốc độ mọc hơi nhanh, dạng bông hơi xồm; ở tâm có màu trắng đục sau lan ra ngoài ngoài cùng là sợi nấm mọc thành cụm theo nhiều hướng, tơi xốp và có màu vàng nhạt (Hình 3.5a,b). Cơ quan sinh sản: Tế bào màng trong , đơn độc, bề mặt cuống bào tử nhẵn; bào tử hình oval, kết thành từng cụm, có từ 0 đến 1 vách ngăn; đại bào tử ít, tiểu bào tử chủ yếu mọc từ nhánh bên với cuống sinh sản (Hình 3.5c). chủng nấm AG 3.4.2 có khả năng thuộc họ nấm Fusarium sp. [28].
➢ Nhóm 4, mẫu đại diện AG 10.3.3
Hình 3.6. Hình thái nấm trên môi trường PDA và hình thái bào tử mẫu (a: mặt trên, b: mặt dưới, c: hình thái bào tử)
Khuẩn lạc được nuôi cấy trên môi trường PDA, nhiệt độ 25oC, ánh sáng thường, tuổi phân loại 7 ngày, tốc độ mọc tương đối nhanh, dạng bông mịn, tâm có màu xanh, vùng ngoài dạng bột dày có màu xanh xen kẽ trắng đục, mặt dưới có màu xanh nhạt (Hình 3.6a,b). Cơ quan sinh sản: Sợi nấm dinh dưỡng màu xanh đen, có vách ngăn; cuống không có sự phân nhánh, bào tử tròn, cuống bào tử đính trong suốt, nhẵn (Hình 3.6c). Chủng nấm AG 3.4.2 có khả năng thuộc họ nấm
Trichoderma sp. [28].
c b
a
➢ Nhóm 5, mẫu đại diện AG 3.1.3.1
Hình 3.7. Hình thái nấm trên môi trường PDA và hình thái bào tử mẫu (a: mặt trên, b: mặt dưới, c: hình thái bào tử)
Khuẩn lạc được nuôi cấy trên môi trường PDA, nhiệt độ 25oC, ánh sáng thường, tuổi phân loại 7 ngày, tốc độ mọc nhanh, dạng xốp; mặt phải màu trắng hồng; mặt trái màu hồng (Hình 3.7a,b). Cơ quan sinh sản: Sợi nấm trong đục, bào tử đính trong suốt bào tử đính hình cầu, kết thành từng chuỗi (Hình 3.7c). Chủng nấm AG 3.1.3.1 có khả năng thuộc họ nấm Aspergillus sp. [28].
➢ Nhóm 6, mẫu đại diện AG 3.3.1
Hình 3.8. Hình thái nấm trên môi trường PDA và hình thái bào tử mẫu (a: mặt trên, b: mặt dưới, c: hình thái bào tử)
Khuẩn lạc được nuôi cấy trên môi trường PDA, nhiệt độ 25oC, ánh sáng thường, tuổi phân loại 5 ngày, tốc độ mọc hơi nhanh; sợi nấm phát triển dày đặc như bông gòn, màu trắng, tơi xốp bao khắp đĩa, và đến thời điểm 7 ngày sợi nấm bắt đầu chuyển sang màu vàng (Hình 3.8a,b). Cơ quan sinh sản: sợi nấm có màu
a b c
c b
trắng, bào tử nhẵn, đơn bào, hình cầu, hình thành đơn lẻ (Hình 3.8c). Chủng nấm AG 3.3.1 có khả năng thuộc họ nấm Neurospora sp. [28].
➢ Nhóm 7, mẫu đại diện AG 5.1.2
Hình 3.9. Hình thái nấm trên môi trường PDA và hình thái bào tử mẫu (a: mặt trên, b: mặt dưới, c: hình thái bào tử)
Khuẩn lạc được nuôi cấy trên môi trường PDA, nhiệt độ 25oC, ánh sáng thường, tuổi phân loại 5 ngày, tốc độ mọc nhanh; dạng như sợi bông vải khi còn non và sau đó có màu sậm hơn do hình thành lập thể mang bọc bào tử vách dày (Hình 3.9a,b). Cơ quan sinh sản: Bề mặt cuống nhẵn, không màu, có màu nâu gần sát bọng; bào tử có dạng hình cầu, màu nâu nhạt (Hình 3.9c). Chủng nấm AG 3.3.1 có khả năng thuộc họ nấm Bipolaris sp. [28].
3.2.2. Phân lập, làm thuần và quan sát hình thái ở tỉnh Kiên Giang
Từ 100 mẫu lúa có dấu hiệu nhiễm nấm bệnh được thu nhận tại tỉnh Kiên Giang. Sau đó mẫu lá, cổ bông, bông lúa, hạt lúa bị nhiễm bệnh tiến hành phân lập, làm thuần được 263 chủng nấm và chọn lọc được 8 nhóm nấm có hình thái giống nhau và chọn ra một chủng đại diện được mô tả cụ thể ở Bảng 3.2
Bảng 3.2. Kết quả phân lập làm thuần mẫu ở tỉnh Kiên Giang
Nhóm Số (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
lượng Danh sách mẫu Đại diện
Nhóm 1 50 KG 2.2.1.2; KG 3.1.1.1; KG 3.1.1.1; KG 3.2.1; KG 3.2.2; KG 5.1.2.2; KG 5.1.4.2; KG 6.1.3; KG 1.1.1 c b a
KG 6.3.2; KG 10.1.3; KG 14.1.3; KG 17.1.1; KG 18.1.4; KG 24.3.1; KG 29.2.1; KG 29.2.2; KG 34.2.1; KG 37.1.3; KG 15.1.8; KG 16.2.1; KG 20.1.2; KG 25.2.2; KG 5.3.3.2; KG 1.3.1; KG 1.2.2.2; KG 3.1.3; KG 4.1.2; KG 4.2.1; KG 4.3.1.2; KG 6.1.1; KG 6.1.2; KG 6.3.3; KG 7.1.1; KG 7.1.3; KG 7.1.4; KG 7.2.1; KG 7.2.2; KG 8.1.4; KG 9.1.4; KG 10.1.4; KG 11.1.3; KG 11.3.1.2; KG 12.1.3.1; KG 12.1.1; KG 15.1.6; KG 16.3.1; KG 22.1.3.1; KG 25.3.1; KG 29.3.1; KG 32.3.3 Nhóm 2 56 KG 3.1.3; KG 2.2.1.2; KG 3.2.3; KG 4.1.4;