2.1.2.1. Dụng cụ
- Bình cầu cổ nhám hai cổ 100 mL. - Bình cầu cổ nhám hai cổ 500 mL. - Bình cầu cổ nhám ba cổ 250 mL.
- Ống nhỏ giọt, ống đong, becher (50mL, 100 mL, 250 mL), bình định mức (10 mL, 25 mL, 50 mL, 100 mL).
- Phễu lọc hút chân khơng, micropipette, cá từ, khĩa nhám cung cấp nitơ, nhiệt kế, bếp khuấy nhiệt, hai van khĩa, giá đỡ.
- Túi thẩm tách Spectra Por Regenerated Cellulose Membrane MWCO 12000-14000.
2.1.2.2. Thiết bị
- Máy cơ quay chân khơng Buxchi Rotavapor R-200, Heating Bath B- 490.
- Tủ hút chân khơng OV-01, tủ sấy, máy khuấy từ cĩ hiệu chỉnh nhiệt độ: OMNILAB, type RCT S26 batch Inpected UPAE 117537.
- Cân phân tích điện tử - HADAM AEP-250G (5 số lẻ).
- Máy phân tích hồng ngoại Fourior FTIR (Fourior transform infrared spectroscopy).
- Máy đơng khơ, FDU-1200 EYELA - Máy siêu âm, Hielscher – Đức. - Máy vortex, Velp – Ý
- Máy ly tâm, Hermle – Đức
- Máy đo kích thước hạt (DLS) và thế Zeta, SZ-100 HORIBA Scientific
- Máy quang phổ UV-1800, Shimadzu – Nhật - Máy HPLC (PerkinElmer PDA Flexar) 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Tổng hợp hệ copolymer Chitosan-Pluronic
2.2.1.1. Tổng hợp NPC-Pluronic-NPC
Cân 15 gam F127 (12600 gam/mol) cho vào bình cầu 3 cổ 250mL, hút chân khơng trong 1 giờ 30 phút (loại hơi nước). Đồng thời gia nhiệt cho bếp đến khi bếp đạt 80 °C và F127 tan hết. Sau đĩ, khĩa bơm, dẫn khí N2, cho 0,5 gam (0,0024 mol) NPC vào bình cầu và khuấy từ ở nhiệt độ 70-80 °C. Phản ứng thực hiện trong 5 giờ. Dừng gia nhiệt, cho 40 mL THF vào và khuấy ở nhiệt độ phịng.
Dung dịch thu được đem đi tủa trong 250 mL diethyl ether ở nhiệt độ 0 °C, thời gian 3 giờ. Hỗn hợp được lọc hút chân khơng. Sản phẩm thu được tiếp tục được rửa lại với diethyl ether. Sau đĩ, sản phẩm được đem cơ quay để loại hồn tồn dung mơi cịn sĩt lại đến khối lượng khơng đổi. Sản phẩm thu được ở dạng bột cĩ màu trắng mịn, lấy một ít mẫu đem đi đo phổ 1H-NMR để xác định cấu trúc F127 sau khi hoạt hĩa bởi NPC.
2.2.1.2. Tổng hợp NPC-Pluronic-OH
Phương trình hĩa học
Hình 2.2. Phương trình phản ứng tổng hợp NPC-F127-OH
Cho 15 gam NPC-F127-NPC đã cơ quay vào bình 3 cổ, hịa tan với 50 mL THF. Nhỏ giọt 3-amino-1-propanol (0,0012 mol và d=0,982 gam/lit) đã pha lỗng vào dung dịch 50 mL THF, khuấy từ trong 12 giờ ở nhiệt độ phịng.
Dung dịch thu được đem đi tủa trong 250 mL diethyl ether ở nhiệt độ 0 oC, thời gian 3 giờ.
Sau đĩ hỗn hợp được lọc hút chân khơng, sản phẩm được đem đi cơ quay để loại hồn tồn dung mơi cịn sĩt lại đến khối lượng khơng đổi. Sản phẩm thu được cĩ màu trắng mịn, lấy một ít chất rắn đem đi đo phổ 1H-NMR để xác định cấu trúc NPC-F127-NPC sau khi gắn với 3-amino-1-propanol.
2.2.1.3. Tổng hợp hệ copolymer Chitosan-Pluronic (CP)
Phương trình hĩa học
Hình 2.3. Phương trình phản ứng tổng hợp copolymer chitosan- pluronic F127 (CP-F127)
Cân 0,25g Chitosan hồ tan trong nước cất ở mơi trường pH~3 được tạo ra bởi dung dịch HCl 0,1% và khuấy đều trong 24 giờ, điều chỉnh pH về 5,5 rồi đem lưu trữ ở nhiệt độ 4 °C cho phản ứng tiếp theo. NPC–F127–Amin 3,75g hồ tan trong nước cất ở nhiệt độ 4 °C, khuấy khoảng 1 giờ, rồi đem giữ ở nhiệt độ 4 °C trong 24 giờ. Dung dịch NPC- F127- Amin được cho vào dung dịch Chitosan lạnh và khuấy trong 24 giờ ở nhiệt độ phịng và giữ lạnh ít nhất 24 giờ trước khi đem
thẩm tách với mang cellulose (12000-14000 MW). Thẩm tách trong nước cất diễn ra trong khoảng một tuần trước khi đem mẫu đi đơng khơ.
2.2.2. Tổng hợp hệ Chitosan-Pluronic mang Paclitaxel và Quercetin
2.2.2.1. Tổng hợp hệ copolymer Chitosan-Pluronic mang Quercetin
Hịa tan 200 mg CP vào 2 mL nước DI, khuấy từ trong khoảng 4h, ở nhiệt độ từ 4 °C-10 °C, đến khi mẫu tan hồn tồn. 20 mg QU được hịa tan trong 10 mL dung mơi Ethanol. Nhỏ từ từ từng mL dung mơi Ethanol vào dung dịch CP đang khuấy từ cho đến khi mẫu được phân tán hồn tồn, tạo thành dung dịch trong suốt. Nhỏ từ từ dung dịch QU vào dung dịch CP. Đánh siêu âm hỗn hợp QU và CP trong vịng 1 phút, để tạo thành dung dịch đồng nhất. Sau đĩ cơ quay loại bỏ dung mơi, thêm vào 10 mL nước DI để hịa tan lại mẫu. Sau đĩ ly tâm loại phần tủa lấy phần nước trong đem đơng khơ thu được sản phẩm là CP – QU 10% cĩ dạng rắn, màu vàng nhạt.
2.2.2.2. Tổng hợp hệ copolymer Chitosan-Pluronic mang Paclitaxel
Hịa tan 200 mg CP-QU 10% vào 2 mL nước DI, khuấy từ ở nhiệt độ từ 4 °C-10 °C, đến khi mẫu tan hồn tồn. 4 mg PTX được hịa tan trong 10 mL dung mơi Ethanol. Nhỏ từ từ từng mL dung mơi Ethanol vào dung dịch CP-QU 10% đang khuấy từ cho đến khi mẫu được phân tán hồn tồn, tạo thành dung dịch trong suốt. Nhỏ từ từ dung dịch PTX vào dung dịch CP. Đánh siêu âm hỗn hợp PTX và CP trong vịng 1 phút, để tạo thành dung dịch đồng nhất. Sau đĩ cơ quay loại bỏ dung mơi, thêm vào 10 mL nước DI để hịa tan lại mẫu. Sau đĩ ly tâm loại phần tủa lấy phần nước trong đem đơng khơ, thu được sản phẩm là CP - QU 10% và PTX 2% cĩ dạng rắn, màu vàng nhạt.
2.2.3. Xây dựng phương pháp thẩm định Paclitaxel
Thiết bị: máy HPLC PERKIN ELMER gồm: Degasser, quaternary pump, DAD detector.
Bước sĩng phân tích: 227 nm Thể tích tiêm mẫu: 20µL
Pha động: kênh A: 0,1% phosphoric Acid, kênh B: Acetonitril, tốc độ dịng: 1 mL/phút
Bảng 2.1. Chương trình dung mơi chạy máy sắc ký HPLC
Thời gian (phút) %A %B
1 50 50
3 50 50
10 5 95
9 5 95
2.2.3.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch thử PTX
- Dung dịch chuẩn gốc 100 mg/L: Cân chính xác 1 mg mẫu PTX chuẩn, cho vào bình định mức 10 mL, thêm khoảng 3 mL dung mơi methanol, lắc đều. Siêu âm trong 20 phút. Thêm dung mơi methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều để yên trong 5 phút.
- Mẫu thử 50 mg/L: Cân chính xác 0,5 mg mẫu chứa PTX, cho vào bình định mức 10 mL, thêm khoảng 3 mL dung mơi methanol. Lắc đều, siêu âm 20 phút. Thêm Methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều, để lắng 5 phút. Lọc qua màng lọc 0,45 µm.
- Mẫu chuẩn 50 mg/L: Hút 5 ml dung dịch chuẩn gốc 100 mg/L thêm vào bình định mức 10 mL, thêm dung mơi methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều, để yên trong 5 phút. Lọc dung dịch qua màng lọc 0,45 μm.
2.2.3.2. Khảo sát tính tương thích hệ thống
Cách tiến hành:
- Cân bằng cột sắt ký bằng pha động trong 60 phút. - Tiến hành sắc ký mẫu chuẩn 50 mg/L, 6 lần liên tiếp
- Tính độ lệch chuẩn tương đối (%RSD) của các thơng số trên theo cơng thức: x SD RSD % Trong đĩ:
- % RSD: độ lệch chuẩn tương đối, để biểu diễn sự sai lệch giữa các dữ liệu
- SD: Độ lệch chuẩn, phản ánh độ phân tán của các dữ liệu
1 ) ( 2 n x x SD i x: giá trị trung bình Yêu cầu:
-Độ lệch chuẩn tương đối % RSD của diện tích peak: ≤ 2,0 % -Độ lệch chuẩn tương đối % RSD của thời gian lưu: ≤ 2,0 % -Số đĩa lý thuyết của đỉnh chính N: ≥ 2000.
-Giá trị trung bình của Hệ số khơng đối xứng T: ≤ 2,5 (13)
2.2.3.3. Độ đặc hiệu
Cách tiến hành:
Chuẩn bị 3 mẫu dung dịch: mẫu trắng, mẫu thử, mẫu chuẩn:
- Mẫu trắng: Chuẩn bị 20 mL dung mơi methanol. Lọc qua màng lọc 0,45 μm.
- Mẫu thử 5 mg/L: Hút 2 ml dung dịch thử 50 mg/L thêm vào bình định mức 20 mL, thêm dung mơi methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều, để yên trong 5 phút.
- Mẫu chuẩn 50 mg/L.
Yêu cầu:
-Sắc ký đồ mẫu trắng khơng cho peak ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn.
-Sắc ký đồ mẫu thử cho peak cĩ thời gian lưu tương tự với peak của chất chuẩn trong sắc ký đồ mẫu chuẩn.
-Trên sắc ký đồ mẫu thử, nếu cĩ xuất hiện thêm các peak khác peak của chất cần phân tích (peak tạp), thì các peak tạp này phải tách hồn tồn với peak của chất cần phân tích đồng thời đáp ứng các yêu cầu chung của phương pháp sắc ký lỏng được quy định.
2.2.3.4. Khảo sát khoảng tuyến tính
Cách tiến hành: từ dung dịch chuẩn gốc S0 100 mg/L, pha tiếp 6 mẫu
dung dịch chuẩn ở các nồng độ từ 1 mg/L đến 50 mg/L:
Bảng 2.2. Mẫu dung dịch chuẩn để khảo sát tính tuyến tính của PTX Dung dịch chuẩn Nồng độ PTX (mg/L) Cách pha S0 (mL) Thể tích cần định mức (mL) 1 1 0.1 10 2 5 0.5 3 10 1 4 20 2 5 40 4 6 50 5
Lọc 6 mẫu qua màng lọc 0,45 μm. Tiến hành sắc ký trên 6 mẫu dung dịch chuẩn và lập đường biểu diễn tương quan giữa diện tích và nồng độ chuẩn để xác định phương trình hồi quy.
2.2.3.5. Giới hạn phát hiện – Giới hạn định lượng
Phương pháp xác định LOD, LOQ:
LOD cĩ thể được xác định dựa vào độ dốc của đường chuẩn và độ lệch chuẩn của tín hiệu đo, theo cơng thức sau:
a SD
LOD
3,3
Trong đĩ:
- LOD: nồng độ giới hạn phát hiện (mg/L) - SD: Độ lệch chuẩn của tín hiệu
- a: độ dốc của đường chuẩn
Giá trị a cĩ thể dễ dàng tính được từ đường chuẩn, giá trị SD được tính dựa trên độ lệch chuẩn của mẫu chuẩn ở nồng độ nhỏ gần LOD, lặp lại 6 lần.(13)
Tính giá trị LOQ theo cơng thức sau: (13)
3.3
LOQ LOD
Trong đĩ:
LOQ: nồng độ giới hạn định lượng (mg/L) LOD: nồng độ giới hạn phát hiện (mg/L)
Cách tiến hành:
-Pha lỗng mẫu chuẩn 50 mg/L đến 1 mg/L.
-Tiến hành sắc ký mẫu 6 mg/L với 6 lần song song, tại cùng điều kiện sắc ký.
-Tính giá trị trung bình x, độ lệch chuẩn SD, LOD, LOQ. (13)
2.2.3.6. Độ đúng
Phương pháp: Việc xác định độ đúng cĩ thể được thực hiện thơng qua
tích các mẫu thêm chuẩn, lặp lại tối thiểu ba lần bằng phương pháp khảo sát, tính độ thu hồi theo cơng thức sau: (13)
Trong đĩ: - Cm+c : Nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn (mg/L)
- Cm : Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử (mg/L) - Cc: Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết) (mg/L)
Cách tiến hành:
-Cân chính xác 0,25 mg mẫu PTX hịa tan trong methanol và định mức trong bình định mức 100 mL thu được dung dịch mẫu thơ (dung dịch A) cĩ nồng độ lý thuyết 2,5 mg/L.
-Cân chính xác lần lượt mẫu chuẩn 0,2 mg, 0,25 mg, 0,3 mg hịa tan trong bình định mức 10 mL bằng methanol. Hút 1 mL lần lượt các dung dịch chuẩn cĩ nồng độ 20 mg/L, 25 mg/L và 30 mg/L, pha lỗng trong bình định mức 10 mL bằng dung dịch A, được các dung dịch với nồng độ của mẫu chuẩn thay đổi 80 %, 100 % và 120 % so với mẫu thử.
-Tiến hành phân tích ở mỗi nồng độ trên với 3 lần liên tiếp tại cùng điều kiện sắc ký. Tính hàm lượng của mẫu thử thêm chuẩn ở từng nồng độ, % độ phục hồi (R%) ở từng nồng độ thêm vào, độ lệch chuẩn tương đối (% RSD).
Yêu cầu: Tỷ lệ phục hồi ở từng nồng độ và các mẫu ở mỗi nồng độ phải
đạt trong khoảng 90 – 107 %, % RSD ≤ 2,0 % (13)
2.2.3.7. Độ lặp lại
Độ lặp lại được khảo sát bằng cách tiến hành làm đo lặp lại 6 lần trên cùng một mẫu. % 100 % c m c m C C C R
-Chuẩn bị mẫu thử nồng độ 50 mg/L.
-Tiến hành định lượng mẫu 6 lần với điều kiện sắc ký đã được tối ưu hĩa. Kết quả đánh giá dựa trên độ lệch chuẩn tương đối % RSD của nồng độ.
Yêu cầu: % RSD ≤ 2,0 %
2.2.4. Đánh giá đặc tính cấu trúc của hệ copolymer
2.2.4.1. Đánh giá cấu trúc của hệ copolymer bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR
Để đánh giá các cấu trúc của NPC-Pluronic-NPC, NPC-Pluronic-OH, và CP ta dùng phương pháp đo cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR để chứng minh việc tổng hợp đã thành cơng. Polymer được hịa tan trong dung mơi Deutereted Cloroform (CDCl) hoặc nước D2O sau đĩ đo phổ proton 1H-NMR bằng máy phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Bruker Advance 500MHz) tại Viện Hĩa Học- Viện Hàn Lâm Khoa Học Và Cơng Nghệ Việt Nam với chất chuẩn là tetramethyl silane (TMS) cĩ độ dịch chuyển δ (ppm) bằng 0. Dựa vào độ dịch chuyển hĩa học của các proton trên phổ đồ để nhận biết sự cĩ mặt của các nhĩm chức khác nhau.
2.2.4.2. Đánh giá cấu trúc của hệ copolymer bằng phổ hồng ngoại (IR)
Để đánh giá các cấu trúc của NPC-Pluronic-NPC, NPC-Pluronic-OH, và CP ta dùng phương pháp phân tích phổ hồng ngoại (IR) để chứng việc tổng hợp đã thành cơng.
Cân 0,01 mg mẫu cần phân tích lần lượt là NPC-Pluronic-NPC, NPC- Pluronic-OH, và CP trộn đều với 1mg KBr ép thành màng mỏng, mẫu được đo ở bước sĩng 4000 – 400 cm-1, ghi nhận kết quả phổ.
2.2.4.3. Đánh giá kích thước của hệ copolymer
* Phương pháp tán xạ ánh sáng động học (DLS)
Kích thước hạt được xác định bằng phương pháp tán xạ ánh sáng động học đo bởi máy HORIBA SZ-100 tại Viện Khoa Học Vật Liệu Ứng Dụng- Viện Hàn Lâm Khoa Học Và Cơng Nghệ Việt Nam.
Các mẫu được hịa tan trong nước DI với nồng độ 100 ppm ở nhiệt độ khoảng 15 oC, dùng phương pháp đánh sĩng siêu âm để phân tán hồn tồn mẫu trong nước, lọc lại mẫu để loại bỏ phần thuốc tự do. Tiến hành đo kích thước hạt các mẫu bằng máy HORIBA SZ-100 ở 25 °C.
* Sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)
Kính hiển vi điển tử truyền qua sử dụng chùm điện tử cĩ năng lượng cao chiếu xuyên qua mẫu vật rắn mỏng và sử dụng các thấu kính từ để tạo ảnh với độ phĩng đại lớn (cĩ thể tới hàng triệu lần), ảnh cĩ thể tạo ra trên màn huỳnh quang, hay trên film quang học, hay ghi nhận bằng các máy chụp kỹ thuật số. Chính vì tính chất chiếu xuyên vào vật liệu mà kích thước, sự tách rời và sự phân bố của PTX-QU được bọc trong gel cĩ thể được đánh giá. Hình TEM được đánh giá dựa vào độ phĩng đại (scale) trên hình chụp TEM để ước tính kích thước mẫu cĩ đạt kích thước nano hay khơng.
Hình dạng và kích thước hạt nano được hiển thị rõ ràng hơn thơng qua hình ảnh phĩng đại gấp nhiều lần trong hình ảnh TEM của kính hiển vi điện tử truyền qua( JEM-1400 JEOL) tại Trường Đại Học Bách Khoa- TP. Hồ Chí Minh.
Các mẫu cũng được chuẩn bị cùng điều kiện như phương pháp tán xạ ánh sáng động học nêu trên. 1 µL dung dịch mẫu trong nước DI nồng độ 100 ppm được nhỏ giọt trên khung lưới và để khơ tự nhiên ở 25 °C trong khoảng 6- 7 phút trước khi đặt khung lưới này vào dung dịch uranyl acetate 1% w/w, lắc nhẹ. Tiến hành đo mẫu bằng máy TEM( JEM-1400 JEOL) ở 25 °C.
2.2.5. Đánh giá khả năng mang và phĩng thích thuốc của hệ copolymer CP copolymer CP
2.2.5.1. Khả năng mang và phĩng thích thuốc PTX của hệ copolymer
Xác định khả năng mang PTX
Hàm lượng PTX chứa trong hệ nano được xác định bằng phương pháp