Mẫu dung dịch chuẩn để khảo sát tính tuyến tính của PTX

dung dịch chuẩn ở các nồng độ từ 1 mg/L đến 50 mg/L:

Bảng 2.2. Mẫu dung dịch chuẩn để khảo sát tính tuyến tính của PTX Dung dịch Dung dịch chuẩn Nồng độ PTX (mg/L) Cách pha S0 (mL) Thể tích cần định mức (mL) 1 1 0.1 10 2 5 0.5 3 10 1 4 20 2 5 40 4 6 50 5

Lọc 6 mẫu qua màng lọc 0,45 μm. Tiến hành sắc ký trên 6 mẫu dung dịch chuẩn và lập đường biểu diễn tương quan giữa diện tích và nồng độ chuẩn để xác định phương trình hồi quy.

2.2.3.5. Giới hạn phát hiện – Giới hạn định lượng

Phương pháp xác định LOD, LOQ:

LOD cĩ thể được xác định dựa vào độ dốc của đường chuẩn và độ lệch chuẩn của tín hiệu đo, theo cơng thức sau:

a SD

LOD 

3,3

Trong đĩ:

- LOD: nồng độ giới hạn phát hiện (mg/L) - SD: Độ lệch chuẩn của tín hiệu

- a: độ dốc của đường chuẩn

Giá trị a cĩ thể dễ dàng tính được từ đường chuẩn, giá trị SD được tính dựa trên độ lệch chuẩn của mẫu chuẩn ở nồng độ nhỏ gần LOD, lặp lại 6 lần.(13)

Tính giá trị LOQ theo cơng thức sau: (13)

3.3

LOQ LOD

Trong đĩ:

LOQ: nồng độ giới hạn định lượng (mg/L) LOD: nồng độ giới hạn phát hiện (mg/L)

Cách tiến hành:

- Pha lỗng mẫu chuẩn 50 mg/L đến 1 mg/L.

- Tiến hành sắc ký mẫu 6 mg/L với 6 lần song song, tại cùng điều kiện

sắc ký.

- Tính giá trị trung bình x, độ lệch chuẩn SD, LOD, LOQ. (13)

2.2.3.6. Độ đúng

Phương pháp: Việc xác định độ đúng cĩ thể được thực hiện thơng qua

tích các mẫu thêm chuẩn, lặp lại tối thiểu ba lần bằng phương pháp khảo sát, tính độ thu hồi theo cơng thức sau: (13)

Trong đĩ: - Cm+c : Nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn (mg/L)

- Cm : Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử (mg/L) - Cc: Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết) (mg/L)

Cách tiến hành:

- Cân chính xác 0,25 mg mẫu PTX hịa tan trong methanol và định mức trong bình định mức 100 mL thu được dung dịch mẫu thơ (dung dịch A) cĩ nồng độ lý thuyết 2,5 mg/L.

- Cân chính xác lần lượt mẫu chuẩn 0,2 mg, 0,25 mg, 0,3 mg hịa tan trong bình định mức 10 mL bằng methanol. Hút 1 mL lần lượt các dung dịch chuẩn cĩ nồng độ 20 mg/L, 25 mg/L và 30 mg/L, pha lỗng trong bình định mức 10 mL bằng dung dịch A, được các dung dịch với nồng độ của mẫu chuẩn thay đổi 80 %, 100 % và 120 % so với mẫu thử.

- Tiến hành phân tích ở mỗi nồng độ trên với 3 lần liên tiếp tại cùng điều kiện sắc ký. Tính hàm lượng của mẫu thử thêm chuẩn ở từng nồng độ, % độ phục hồi (R%) ở từng nồng độ thêm vào, độ lệch chuẩn tương đối (% RSD).

Yêu cầu: Tỷ lệ phục hồi ở từng nồng độ và các mẫu ở mỗi nồng độ phải

đạt trong khoảng 90 – 107 %, % RSD ≤ 2,0 % (13)

2.2.3.7. Độ lặp lại

Độ lặp lại được khảo sát bằng cách tiến hành làm đo lặp lại 6 lần trên cùng một mẫu. % 100 %     c m c m C C C R

- Chuẩn bị mẫu thử nồng độ 50 mg/L.

- Tiến hành định lượng mẫu 6 lần với điều kiện sắc ký đã được tối ưu hĩa. Kết quả đánh giá dựa trên độ lệch chuẩn tương đối % RSD của nồng độ.

Yêu cầu: % RSD ≤ 2,0 %

2.2.4. Đánh giá đặc tính cấu trúc của hệ copolymer

2.2.4.1. Đánh giá cấu trúc của hệ copolymer bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR

Để đánh giá các cấu trúc của NPC-Pluronic-NPC, NPC-Pluronic-OH, và CP ta dùng phương pháp đo cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR để chứng minh việc tổng hợp đã thành cơng. Polymer được hịa tan trong dung mơi Deutereted Cloroform (CDCl) hoặc nước D2O sau đĩ đo phổ proton 1H-NMR bằng máy phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Bruker Advance 500MHz) tại Viện Hĩa Học- Viện Hàn Lâm Khoa Học Và Cơng Nghệ Việt Nam với chất chuẩn là tetramethyl silane (TMS) cĩ độ dịch chuyển δ (ppm) bằng 0. Dựa vào độ dịch chuyển hĩa học của các proton trên phổ đồ để nhận biết sự cĩ mặt của các nhĩm chức khác nhau.

2.2.4.2. Đánh giá cấu trúc của hệ copolymer bằng phổ hồng ngoại (IR)

Để đánh giá các cấu trúc của NPC-Pluronic-NPC, NPC-Pluronic-OH, và CP ta dùng phương pháp phân tích phổ hồng ngoại (IR) để chứng việc tổng hợp đã thành cơng.

Cân 0,01 mg mẫu cần phân tích lần lượt là NPC-Pluronic-NPC, NPC- Pluronic-OH, và CP trộn đều với 1mg KBr ép thành màng mỏng, mẫu được đo ở bước sĩng 4000 – 400 cm-1, ghi nhận kết quả phổ.

2.2.4.3. Đánh giá kích thước của hệ copolymer

* Phương pháp tán xạ ánh sáng động học (DLS)

Kích thước hạt được xác định bằng phương pháp tán xạ ánh sáng động học đo bởi máy HORIBA SZ-100 tại Viện Khoa Học Vật Liệu Ứng Dụng- Viện Hàn Lâm Khoa Học Và Cơng Nghệ Việt Nam.

Các mẫu được hịa tan trong nước DI với nồng độ 100 ppm ở nhiệt độ khoảng 15 oC, dùng phương pháp đánh sĩng siêu âm để phân tán hồn tồn mẫu trong nước, lọc lại mẫu để loại bỏ phần thuốc tự do. Tiến hành đo kích thước hạt các mẫu bằng máy HORIBA SZ-100 ở 25 °C.

* Sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)

Kính hiển vi điển tử truyền qua sử dụng chùm điện tử cĩ năng lượng cao chiếu xuyên qua mẫu vật rắn mỏng và sử dụng các thấu kính từ để tạo ảnh với độ phĩng đại lớn (cĩ thể tới hàng triệu lần), ảnh cĩ thể tạo ra trên màn huỳnh quang, hay trên film quang học, hay ghi nhận bằng các máy chụp kỹ thuật số. Chính vì tính chất chiếu xun vào vật liệu mà kích thước, sự tách rời và sự phân bố của PTX-QU được bọc trong gel cĩ thể được đánh giá. Hình TEM được đánh giá dựa vào độ phĩng đại (scale) trên hình chụp TEM để ước tính kích thước mẫu cĩ đạt kích thước nano hay khơng.

Hình dạng và kích thước hạt nano được hiển thị rõ ràng hơn thơng qua hình ảnh phĩng đại gấp nhiều lần trong hình ảnh TEM của kính hiển vi điện tử truyền qua( JEM-1400 JEOL) tại Trường Đại Học Bách Khoa- TP. Hồ Chí Minh.

Các mẫu cũng được chuẩn bị cùng điều kiện như phương pháp tán xạ ánh sáng động học nêu trên. 1 µL dung dịch mẫu trong nước DI nồng độ 100 ppm được nhỏ giọt trên khung lưới và để khơ tự nhiên ở 25 °C trong khoảng 6- 7 phút trước khi đặt khung lưới này vào dung dịch uranyl acetate 1% w/w, lắc nhẹ. Tiến hành đo mẫu bằng máy TEM( JEM-1400 JEOL) ở 25 °C.

2.2.5. Đánh giá khả năng mang và phĩng thích thuốc của hệ copolymer CP copolymer CP

2.2.5.1. Khả năng mang và phĩng thích thuốc PTX của hệ copolymer

 Xác định khả năng mang PTX

Hàm lượng PTX chứa trong hệ nano được xác định bằng phương pháp HPLC với bước sĩng hấp thu lớn nhất ở 227 nm. Mẫu CP mang PTX được hịa

0,45 µm. Mẫu được tiêm trực tiếp vào máy HPLC với chương trình chạy của mục 2.2.3 nhằm xác định hàm lượng PTX cĩ trong mẫu.

 Khảo sát khả năng giữ thuốc PTX của hệ CP trong mơi trường đệm Việc khảo sát khả năng phĩng thích thuốc PTX ở tỷ lệ 2% trong hệ copolymer CP được thực hiện bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao.

Xác định nồng độ Paclitaxel nhả ra từ hệ copolymer CP, trong mơi trường PBS (phosphate-buffered saline) pH bằng 7,4 chuẩn bị 1 mL mẫu hệ copolymer CP ở 6000 ppm trong đĩ nồng độ PTX trong mẫu 120 ppm.

Sau đĩ cho vào màng thẩm tách 3,5 kDa, thẩm tách trong 10 mL dung dịch PBS, ở điều kiện 37 °C và khuấy từ 50 vịng/phút. Sau mỗi khoảng thời gian khác nhau 0h, 0,5h, 3h, 6h, 24h; 48h hút ra 2 mL dung dịch PBS cĩ chứa PTX đã được phĩng thích, sau đĩ cho vào 2 mL PBS mới vào bình thẩm tách để đảm bảo thể tích dung dịch khơng bị thay đổi. Lượng PTX phĩng thích ra được tính theo cơng thức:

Trong đĩ:

- Q : Lượng PTX được nhả ra từ nanogel - Ct : Nồng độ ở thời điểm thứ t

- V : Tổng Thể tích của đệm PBS - Vi : Thể tích PBS được thay thế

- Ci : Nồng độ PTX nhả ra tại thời điểm i

2.2.5.2. Khả năng mang và phĩng thích thuốc QU của hệ copolymer

 Xác định khả năng mang QU

Hàm lượng quercetin chứa trong hệ nano được xác định bằng phương pháp quang phổ tử ngoại UV- Vis (Agilent 8453 UV-Vis Spectrophotometer) với bước sĩng hấp thu lớn nhất ở 374 nm. Quercetin tinh khiết được hịa tan trong ethenol : D2O (1:1) với các nồng độ 0-5 ppm để dựng đường chuẩn, mẫu được cho vào cuvet, đặt cuvet vào máy Agilent 8453 UV-Vis

Spectrophotometer và tiến hành đo mẫu. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của QU được trình bày ở bảng 2.3.