Mẫu gian lưu Thời Diện tích peak Số đĩa lý thuyết (N) Hệ số khơng đối xứng (T)
1 11,322 3568067 31218 0,01400 2 11,323 3561426 31221 0,01401 3 11,321 3574900 31215 0,01401 4 11,324 3568518 31224 0,01403 5 11,320 3571354 31212 0,01406 6 11,325 3575609 31227 0,01404 TB 11,323 3569979 31220 0,01400 SD 0,002 5,229 %RSD 0,02 0,15
- % RSD 6 lần tiêm lặp lại của thời gian lưu: 0,02% < 2% - % RSD 6 lần tiêm lặp lại của diện tích peak: 0,14% < 2%
- Giá trị trung bình của số đĩa lý thuyết của đỉnh chính: 31220 > 2000 - Giá trị trung bình của Hệ số khơng đối xứng T: 0,014 < 2,5
Kết luận: Phương pháp đạt tính tương thích hệ thống. 3.2.2. Độ đặc hiệu
Khảo sát 3 mẫu bao gồm: Mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thử.
Nhận xét:
- Các peak PTX của mẫu chuẩn và mẫu thử cĩ hình dạng đối xứng - Sắc ký đồ mẫu trắng khơng cho peak ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của mẫu chuẩn và mẫu thử.
- Sắc ký đồ mẫu thử cho peak PTX cĩ thời gian lưu tương tự với peak của PTX trong sắc ký đồ mẫu chuẩn.
- Trên sắc ký đồ mẫu thử cĩ xuất hiện thêm peak khác, peak này tách hồn tồn với peak của PTX và đáp ứng các yêu cầu chung của phương pháp sắc ký lỏng.
Kết luận: Phương pháp đạt độ đặc hiệu
Hình 3.9. Sắc ký đồ ghép thể hiện độ đặc hiệu của 3 mẫu: mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thử
3.2.3. Khảo sát khoảng tuyến tính
Tiến hành kháo sát độ tuyến tính giữa nồng chất cần định lượng với diện tích peak tương ứng trên chất chuẩn PTX. Chuẩn bị một dãy nồng độ dung dịch chuẩn biến thiên trong khoảng 1-50 mg/L. Kết quả khảo sát nồng độ tuyến tính được trình bày ở bảng 3.3.
Nhận xét:
Kết quả phân tích cho thấy diện tích peak và nồng độ PTX phụ thuộc tuyến tính với nhau chặt chẽ, thể hiện hệ số tương quan: R2 = 0,9997, khoảng nồng độ tuyến tính từ 1-50 mg/l. Do đĩ cĩ thể sử dụng phương pháp đường chuẩn để định lượng PTX trong mẫu thật.
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát độ tuyến tính
Dung dịch chuẩn Nồng độ (mg/L) Diện tích peak
1 1 74216 2 5 338795 3 10 696232 4 20 1394440 5 40 2720183 6 50 3568067
Phương trình hồi quy y = 70912x - 13247
Hệ số tương quan R² = 0,9997
Hình 3.10. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích peak tương ứng của chất chuẩn PTX
Hình 3.11. Sắc ký đồ ghép của các mẫu lập đường chuẩn
3.2.4. Giới hạn phát hiện – Giới hạn định lượng
Bảng 3.3. Kết quả giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
Kết luận:
- Giới hạn phát hiện LOD: 0,15 mg/L - Giới hạn định lượng LOQ: 0,50 mg/L
Mẫu thử Diện tích peak Số liệu thơng kế
1 469664 n = 6 474273 x SD = 3257,32 LOD = 0.,5 mg/l LOQ = 0,50 mg/l 2 474628 3 473918 4 477464 5 471791 6 478173
3.2.5. Độ đúng
Khảo sát độ đúng bằng phương pháp thêm mẫu thử đã biết trước hàm lượng một lượng chính xác chất chuẩn tương ứng với 80%, 100%, 120% mẫu thử. Kết quả khảo sát được trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ đúng
Kết luận: Các nồng độ khảo sát đều cĩ thu hồi nằm trong khoảng 90 –
107%, %RSD ở 3 mẫu đều nhỏ hơn 2%. Phương pháp phân tích đạt yêu cầu về độ đúng.
3.2.6. Độ lặp lại
Một phương pháp phân tích cĩ độ tin cậy cao, ngồi yêu cầu vể độ đún người ta cịn chú ý đến độ lặp lại giữa các lần đo khi cùng một điều kiện phân tích.
Độ lặp lại của phương pháp được tiến hành trên mẫu chuẩn PTX nồng độ 30 mg/L. Mẫu Nồng độ thêm vào (mg/L) Diện tích peak Nồng độ xác định (mg/L) Hiệu suất thu hồi (R%) TB %RSD Mẫu thử 170457 2,50 Mẫu thử thêm chuẩn 80% 2,10 267394,52 4,45 94,00 93,20 1,49 1,95 266860,80 4,30 94,00 1,90 266614.00 4,19 91,60 Mẫu thử thêm chuẩn 100% 2,60 358484,20 5,19 103,60 102,90 1,47 2,80 373440,30 5,40 104,00 2,50 347044,83 5,03 101,20 Mẫu thử thêm chuẩn 120% 3,10 390481,60 5,64 101,60 101,60 1,57 3,80 441844,90 6,38 103,20 3,10 387324,10 5,60 100
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ lặp lại
Mẫu thử Diện tích peak Nồng độ (mg/l) Số liệu thơng kê
1 2147845 30,47 n = 6 49 , 30 x SD = 0,06 %RSD = 0,19 2 2149993 30,50 3 2145700 30,44 4 2152141 30,53 5 2143558 30,41 6 2154289 30,56 Kết luận:
Với độ lệch chuẩn tương đối %RSD của nồng độ là 0,19% nhỏ hơn 2,0%. Qua kết quả khảo sát, ta thấy dao động giữa các kết quả thử nghiệm cĩ độ lặp lại cao. Phương pháp phân tích ổn định, ít bị ảnh hưởng bởi sai số hệ thống và sai số ngẫu nhiên. Do đĩ, quy trình cĩ thế áp dụng để phân tích mẫu trong kiểm nghiệm.
3.3. KẾT QUẢ CỦA CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ CẤU TRÚC CỦA HỆ COPOLYMER HỆ COPOLYMER
3.3.1. Kết quả của phương pháp đo TEM, DLS của hệ copolymer mang PTX và QU mang PTX và QU
Kết quả chụp TEM cho thấy hình dạng, kích thước các hạt nanogel thơng qua kính điện tử truyền qua TEM thường nhỏ hơn phép đo DLS là do trong phép đo DLS mẫu được hịa tan trong nước nên các hạt nanogel bị phủ một lớp hydrate [8], cịn trong ảnh TEM thì các hạt nanogel làm đã được làm khơ tự nhiên. Cho nên ta thấy trong hình TEM cĩ thể quan sát tháy rõ các hạt cĩ dạng hình cầu và đường đường kính trung bình thể hiện trong ảnh TEM là 90,1± 6,4 nm.
Hình 3.12. Hình chụp TEM và đo DLS của hệ copolymer sau khi nang hĩa thuốc PTX và QU
3.3.2. Kết quả thế zeta của hệ copolymer trước và sau khi mang thuốc PTX và QU thuốc PTX và QU
Hình 3.13. Kết quả thế zeta hệ copolymer trước (A) và sau (B) khi mang thuốc PTX và QU
Thế zeta được xác định bằng cách quan sát chuyển động của các hạt nano trong trường điện thế. Đối với những hạt cĩ kích thước nano thì giá trị của điện thế zeta cao lực đẩy sẽ kìm hãm lực hút làm cho chất phân tán khĩ liên kết lại
- 41,8mV
B
với nhau và ngược lại. Giá trị điện thế zeta chỉ ra mức độ lực đẩy giữa các phân tử cĩ cùng điện tích hay giữa các phân tử tiếp nối nhau.
Thế zeta là hiệu điện thế xuất hiện trong lớp điện kép ở ranh giới giữa pha rắn và pha lỏng, tức điện thế trên bề mặt của các hạt nanogel trong nước. So sánh kết quả thế zeta của của các hệ nanogel trước và sau khi nang hĩa thuốc nhận thấy rằng các hệ nanogel khi chưa mang thuốc thế zeta cĩ giá trị dương rất cao 59,3 mV vì trong hệ cĩ gắn Chitosan mang tính dương điện. Sau khi nang hĩa thuốc thế zeta các mẫu đều giảm xuống -41,8 mV, điều này cĩ thể được giải thích do các thuốc cĩ tính âm điện (PTX;QU) đã được gắn kết với Chitosan bằng một lực hút tĩnh điện, xảy ra sự trung hịa điện làm tính dương điện trên Chitosan bị giảm và thế zeta của hệ nanogel giảm xuống.
3.4. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG NANG HĨA VÀ PHĨNG THÍCH THUỐC CỦA HỆ COPOLYMER CP THUỐC CỦA HỆ COPOLYMER CP
3.4.1. Kết quả đánh giá khả năng nang hĩa PTX và QU
a) Kết quả nang hĩa QU
Để tăng hiệu quả ứng dụng của QU, hoạt chất được điều chế dưới dạng nano trong mơi trường chất hoạt động bề mặt CP là một copolymer ghép nhạy nhiệt (do đặc tính của pluronic F127). Việc kết hợp QU phân tán trong hệ sẽ cải thiện tính kỵ nước của QU và tạo ra hiệu quả cộng hợp của 2 vật liệu.
Hợp chất copolymer CP cĩ màu trắng trong và hệ nanogel CP-QU 10% này cũng cĩ màu vàng đặc trưng rất dễ dàng xác định được nồng độ bằng phương pháp UV-vis với hệ dung mơi ethanol:nước cất (1:1) tại bước sĩng 374 nm.
Hàm lượng QU nang hĩa trong các chất mang nano (EE% và DL%) được xác định gián tiếp thơng qua kết quả đo UV-vis và cơng thức sau, trong đĩ Wtotal-QU là lượng thuốc QU ban đầu và lượng QU được nang hĩa trong chất mang nano là WQU .
%𝐸𝐸 = 𝑊 𝑄𝑈
𝑊𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑄𝑈 × 100%
%𝐷𝐿 = 𝑊 𝑄𝑈
𝑊𝑄𝑈 + 𝑊𝐶𝑃 × 100%
Kết quả thực nghiệm cho thấy, đối với hệ nanogel mang QU, hiệu suất mang thuốc %EE đạt 91,8%, lượng QU cĩ trong hệ nanogel là DL là 8,35%
b) Kết quả nang hĩa PTX
%𝐸𝐸= (𝐿ượ𝑛𝑔 𝑃𝑇𝑋 đượ𝑐 𝑔𝑖ữ 𝑙ạ𝑖 𝑡𝑟𝑜𝑛𝑔 𝑣ậ𝑡 𝑙𝑖ệ𝑢 𝐶𝑃 chia cho 𝑇ổ𝑛𝑔 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑃𝑇𝑋 đ𝑒𝑚 đ𝑖 𝑛𝑎𝑛𝑔 ℎĩ𝑎) × 100%
%𝐷𝐿= (𝐿ượ𝑛𝑔 𝑃𝑇𝑋 đượ𝑐 𝑔𝑖ữ 𝑙ạ𝑖 𝑡𝑟𝑜𝑛𝑔 𝑣ậ𝑡 𝑙𝑖ệ𝑢 𝐶𝑃 chia cho 𝑇ổ𝑛𝑔 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑚ẫ𝑢 )×100%
Kết quả thực nghiệm cho thấy, đối với hệ nanogel mang PTX, hiệu suất mang thuốc %EE đạt 92.99%, lượng PTX cĩ trong hệ nanogel là DL là 1.82%
3.4.2. Kết quả tốc độ giải phĩng thuốc PTX và QU
a) Kết quả tốc độ giải phĩng thuốc PTX của hệ copolymer CP (1:15) Nồng độ thuốc trong mỗi khoảng thời gian xác định bằng phương pháp HPLC với ACN:H2O = 95% : 5% là pha động. Nhiệt độ cột duy trì ở 45 °C. Tính tốn nồng độ thuốc giải phĩng ra dựa trên đường chuẩn PTX đã được xây dựng trong phần thẩm định phương pháp PTX.
Tốc độ giải phĩng thuốc từ hệ copolymer CP (1:15) được thực hiện túi thẩm tách trong dung dịch đệm PBS (pH=7,4). Hình 3.14 biểu đồ cho thấy hệ mẫu cĩ thể giải phĩng thuốc từ từ trong khoảng thời gian 24h. Sau 3h, chỉ cĩ 2,545 ± 0,07% lượng Paclitaxel được giải phĩng từ hệ mẫu.Từ 4h-10h và từ 12h-24h lượng thuốc được giải phĩng với tốc độ khơng đổi. Điều này cho thấy hệ copolymer CP (1:15) sau khi nang hĩa PTX cĩ pha ổn định trong hệ đệm PBS (pH=7,4).
0 6 12 18 24 30 36 42 48 0 20 40 60 80 100 PT X p h ĩ n g t h ích (%) PTX CP-F127-PTX
Hình 3.14. Biểu đồ tốc độ giải phĩng thuốc PTX từ hệ copolymer CP (1:15) trong PBS (pH=7,4)
b) Kết quả tốc độ giải phĩng thuốc QU của hệ copolymer CP (1:15) Trên hình 3.15 biểu đồ thể hiện khả năng giải phĩng QU từ hệ copolymer CP (1:15) và QU tự do. Sau 12 h khảo sát khả năng phĩng thích QU tỷ lệ phĩng thích thuốc QU tự do là 100%. Trong khi đĩ mẫu hệ copolymer CP (1:15) khảo sát cùng thời gian thì hiện tốc độ chậm hơn rất nhiều so với mẫu QU tự do. Hình 3.15 là biểu đồ thể hiện tốc độ giải phĩng hệ copolymer CP (1:15) mang QU, qua kết quả thu được ta thấy mẫu hệ copolymer CP (1:15) cĩ tố độ chậm. Điều này được lý giải như sau, vật liệu hệ copolymer CP (1:15) được kết hợp từ Poloxamer P407 (F127) và chitosan. Pluronic F127 được sử dụng và nghiên cứu nhiều nhất trong các loại poloxamer trên thị trường, với nồng độ 20% w /w trong nước, cĩ thể chuyển dung dịch thành dạng gel trong bằng cách làm ấm hệ gel từ nhiệt độ phịng (25 °C) đến nhiệt độ cơ thể (gần 37 °C). Tính năng phản ứng nhiệt này đã làm cho nĩ hấp dẫn đối với một số ứng dụng bao gồm
một dụng cụ hoặc ống tiêm trước khi tạo gel khi tiếp xúc với cơ thể (35-37 °C). Bởi vì tính tương thích sinh học và khơng độc hại của chúng đã được sử dụng rộng rãi trong ứng dụng y sinh. Cịn về chitosan trong cấu trúc hệ copolymer CP (1:15) là chất biopolymer thường thu được từ vỏ ngồi của giáp xác. Để sản xuất chitosan, chitin được sử dụng sau khi chiết xuất và khử acetyl. Chitosan thể hiện điện tích dương và do đĩ thu hút các mơ và bề mặt mang điện tích âm. Dung dịch nước chitosan đậm đặc dẫn đến sự hình thành gel. Việc kết hợp giữa F127 và chitosan đã tạo ra vật liệu hydrogel nhạy cảm nhiệt độ cùng khả năng trương nở phụ thuộc vào pH mơi trường do đặc tính của CS, hệ gel hệ copolymer CP (1:15) mang điện tích dương. Khi chúng mang hĩa QU, với bản chất là một hoạt chất chống oxi hĩa mang điện tích âm, nên sự tương tác giữa hệ CS-F127 với QU sẽ mạnh, bởi ở đây xảy ra đồng thời tương tác tĩnh điện của khung sườn chitosan và tương tác kỵ nước của các phân tử F127.
0 6 12 18 24 30 36 42 48 0 20 40 60 80 100 QU p h ĩ n g t h ích (%) QU CP-F127-QU
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. KẾT LUẬN:
Đề tài với nội dung là “Tổng hợp dẫn xuất chitosan-pluronic và khảo sát ảnh hưởng của dung dịch đệm lên hiệu quả dẫn truyền Paclitaxel và Quercetin” Sau thời gian thực hiện đã thu được các kết quả như sau :
4.1.1. Tổng hợp dẫn xuất chitosan-pluronic
- Tổng hợp thành cơng dẫn xuất chitosan-pluronic, cấu trúc vật liệu được đánh giá qua phổ 1H-NMR, IR
- Điều chế thành cơng hệ nanogel CP nang hĩa PTX 2% và QU 10% - Vật liệu cĩ khả năng giữ hoạt chất ổn định trong mơi trường đệm.
4.1.2. Xây dựng phương pháp xác định PTX bằng HPLC
- Xây dựng phương pháp xác định và đánh giá hàm lượng PTX trong mẫu CP bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao. Phương pháp đã đạt những thơng số sau:
- Tính tương thích của hệ thống: các thơng số độ lặp lại của thời gian lưu, diện tích peak, số đĩa lý thuyết và hệ số bất đối xứng T đều đạt điều kiện để phân tích định lượng.
- Phương pháp cĩ tính đặc hiệu đối với PTX.
- Ước lượng giới hạn định lượng của phương pháp là 0,5 mg/L và phương pháp cĩ thể phát hiện được PTX với hàm lượng lớn hơn 0,15 mg/L.
- Khoảng tuyến tính của phương pháp nằm trong khoảng 1-50 mg/L. Phương trình hồi quy dạng y = 70912x – 13247 với hệ số tương quan R2 = 0,9997
- Độ đúng của phương pháp được khảo sát dựa vào giá trị độ thu hồi của mẫu thử được thêm chuẩn ở các khoảng hàm lượng 2; 2,5; 3 mg/L. Kết quả cho thấy ở ba khoảng nồng độ thêm vào cho hiệu suất thu hồi dao động từ 93,2– 102,9%.
- Độ lặp lại của phương pháp được xác định dựa vào giá trị độ lặp lại của kết qua đo mẫu thêm chuẩn, kết quả cho thấy tính lặp rất cao của phương pháp với giá trị độ lệch chuẩn tương đối %RSD là 0,19%.
4.2. KIẾN NGHỊ:
- Đề tài này đã dừng lại ở mức độ khảo sát mang và nhả thuốc in-vitro. Tuy vậy, đề tài đã gĩp phần cho thấy tính tiềm năng của copolymer CP-F127 mang PTX và QU trong lĩnh vực y học. Để đưa nghiên cứu này vào cuộc sống, đề tài cần được nghiên cứu sâu và rộng hơn như:
- Khảo sát khả năng mang và nhả thuốc của vật liệu trên các loại thuốc khác nhau, để cĩ đánh giá tổng quan về vật liệu.
- Khảo sát in-vivo, chứng minh khả năng tương hợp sinh học với cơ thể, gĩp phần quan trọng trong việc điều trị các căn bệnh hiện nay.
- Khảo sát thời gian giải phĩng thuốc của vật liệu trong dung dịch đệm pH=5.5 nhằm đánh giá hiệu quả giải phĩng thuốc của vật liệu trong mơi trường sinh lý tế bào ung thư.
- Xây dựng phương pháp thẩm định PTX bằng UV-vis nhằm tối ưu hĩa thời gian, chi phí trong việc định lượng PTX trong vật liệu nano mang PTX.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Cao Văn Dư và các cộng sự (2013), Nghiên cứu tổng hợp và điều chỉnh kích thước hạt nano đồng trong hệ glycerin/PVP, Tạp chí Hĩa học, 51(2), tr.745-749
[2] Morimoto N and et al. (2006), Nanogel Engineered Designs for Polymeric Drug Delivery, Polymeric Drug Delivery Volume II - Polymeric Matrices and Drug Particle Engineering ACS Symposium Series 924. American Chemical Society pp.88-101.
[3] Frank Alexis and et al. (2010), Nanoparticle technologies for cancer therapy, Drug delivery, Handbook of Experimental Pharmacology, p.55-86 [4] Peer, D., Kar, J., Hong, S., Farokhzad, O., Margalit, L.R.(2007). Nanocarriers as an emerging platform for cancer therapy. Nature. 2: 751-760 [5] Escobar-Chávez J. J, Lĩpez-Cervantes M, Nạk A, Kalia Y. N, QuintanarGuerrero D, Ganem-Quintanar A (2006), Applications of thermo- reversiblePluronic F-127 gels in pharmaceutical formulations, J Pharm Pharmaceut Sci. pp. 339-348
[6] Nhat-Anh N. Tong and et al. (2016), Aquated Cisplatin and Heparin- Pluronic Nanocomplexes Exhibiting Sustainable Release of Active Platinum Compound and NCI-H460 Lung Cancer Cell Anti-proliferation, Journal of