3.1. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT VÀ TÁCH FENOBUCARD TRONG NƯỚC
3.1.1. Phương pháp định lượng fenobucarb trên GC/MS
3.1.1.1. Khảo sát các điều kiện đo
Hợp chất fenobucarb thuộc nhóm HCBVTV carbamate để có phương pháp xác định hợp chất này dùng cho các nghiên cứu trong luận văn và để phù hợp với trang thiết bị của phịng thí nghiệm. Chúng tơi sẽ nghiên cứu xác định các điều kiện tối ưu để định lượng hợp chất này trên thiết bị GC/MS.
Khảo sát các điều kiện đo trên thiết bị GC/MS (Trace 2000, Thermo) với hệ lấy mẫu tự động để xác định hợp chất fenobucarb được căn cứ trên các nghiên cứu trước đây [74].
- Với các điều kiện cớ định: 1 µL mẫu được bơm (ở chế độ không chia
dòng), chất phân tích được tách trên cột sắc ký ZB5MSi (dài 30m, đường kính trong 0,25mm, lớp hấp phụ pha tĩnh dày 0,25μm) (Phenomenex). Khí Heli được sử dụng làm khí mang với chế độ tuyến tính (liner velocity flow control mode).
- Các điều kiện được nghiên cứu khảo sát: Nhiệt độ lò cột, nhiệt độ
bơm mẫu, nhiệt độ detector, tốc độ khí mang.
- Các mẫu dùng để khảo sát: Dung dịch chuẩn hợp chất của thuốc trừ
sâu fenobucarb với nồng độ mỗi chất là 1 ppm, và mẫu chiết từ nước cất vào chuẩn hợp chất fenobucarb. Kết quả đã khảo sát chế độ đo với các điều kiện được đưa ra ở bảng 3.1, thời gian lưu và giá trị mảnh phổ của các chất được chỉ ra ở bảng 3.2
+ Lần khảo sát thứ 1: Khi đo dung dịch chuẩn fenobucarb, thời gian
lưu của fenobucarb là 5,21 phút. Khi tiến hành đo mẫu chiết từ nước sơng thì các pic tách nhau khơng rõ và chân pic không đối xứng. Như vậy điều kiện nhiệt độ cột đẳng nhiệt không tách được hợp chất fenobucarb.
+ Lần khảo sát thứ 2: Hạ nhiệt độ cột GC xuống 40oC (thấp hơn nhiệt độ sôi của fenobucarb) giữ trong 1 phút, sau đó tăng nhiệt độ lên 280°C với tốc độ 8°C/phút, và giữ ở nhiệt độ cuối cùng 5 phút. vẫn giữ nhiệt độ bơm mẫu, nhiệt độ nguồn ion, và nhiệt độ detector tương ứng là 250oC, 200°C, và 300oC. Kết quả, thời gian lưu của fenobucarb là 5,52 phút và trên sắc đờ của mẫu có xuất hiện các pic phụ trước đó. Tuy nhiên, khi đo mẫu chiết từ mẫu nước sơng, sắc ký đờ có nhiều pic phụ cạnh pic fenobucarb với chân pic rộng. Phương pháp này dùng để định lượng fenobucarb trong mẫu nước ở các nghiên cứu sau nên điều kiện này cũng không được lựa chọn.
+ Lần khảo sát thứ 3: Giữ nguyên chương trình nhiệt độ GC như lần 2,
nhưng thay đởi chương trình nhiệt độ MS, tăng nhiệt độ ng̀n ion lên 220oC. Kết quả thu được cho thấy ở chế độ này các chất có trong mẫu được tách tốt hơn nhưng vẫn cịn nhiễu nền, đờng thời pic sắc ký của fenobucarb cân, đều và thời gian lưu là 6,28 phút.
+ Lần khảo sát thứ 4: Giữ nguyên chương trình nhiệt độ GC, MS như
lần 3, nhưng giảm tốc độ khí mang xuống 1,15 mL/phút. Kết quả thu được cho thấy ở chế độ này các chất có trong mẫu được tách tốt hơn, đồng thời các pic sắc ký của fenobucarb cân, đều và thời gian lưu là 6,28 phút.
+ Lần khảo sát thứ 5: Giữ nguyên chương trình nhiệt độ MS, tốc độ khí
mang như lần 4, tăng nhiệt độ ban đầu GC lên 90oC. Kết quả thu được cho thấy ở chế độ này chất có trong mẫu vẫn được tách tốt, pic sắc ký cân và đều. Thời gian phân tích rút ngắn là 7 phút. Thời gian lưu của fenobucarb là 6,28 phút (hình 3.1), phở khối của các chất được chỉ ra ở hình 3.2.
Bảng 3.1. Điều kiện khảo sát để định lượng fenobucarb trên thiết bị GC/MS
TT GC MS Tốc độ
dòng khí mang Chương trình nhiệt độ cột Nhiệt độ
bơm mẫu Nhiệt độ nguồn ion Nhiệt độ detector AIQS- DB 400C/2 phút, tăng đến 310°C với tốc độ 8°C/phút giữ ở nhiệt độ cuối cùng 4
phút 250oC 200oC 300oC 1,2 mL/phút Lần 1 1400C 250oC 200oC 300oC 1,2 mL/phút Lần 2 400C/ 2 phút, tăng đến 2800C, tốc độ 80C/phút, giữ
ở nhiệt độ cuối cùng 5 phút 250oC 200oC 300oC
1,2 mL/phút
Lần 3
400C/2 phút, tăng đến 2800C, tốc độ 80C/phút, giữ
ở nhiệt độ cuối cùng 5 phút 250oC 220oC 300oC
1,15 mL/phút
Lần 4
900C/2 phút, tăng đến 3000C, tốc độ 80C/phút, giữ
ở nhiệt độ cuối 4 phút 250oC 220oC 300oC
1,15 mL/phút
Lần 5
900C/2 phút, tăng đến 3000C, tốc độ 80C/phút, giữ
ở nhiệt độ cuối 4 phút 250oC 220oC 300oC
1,15 mL/phút
Hình 3.1. Sắc ký đồ của chuẩn fenobucarb Bảng 3.2. Mảnh phổ chuẩn và thời gian lưu của chất phân tích
Mảnh phổ (m/z) Thời gian lưu (phút)
chính phụ Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Fenobucarb 150 121 5,21 5,52 6,28 6,28 6,28
Hình 3.2. Phổ khối của fenobucarb
Kết quả nghiên cứu đã tiến hành khảo sát được các điều kiện để định lượng hợp chất fenobucarb trên thiết bị GC/MS được xác định như sau:
Mẫu được bơm với thể tích 1 µL ở chế độ khơng chia dòng (splitless) với hệ lấy mẫu tự động và bộ bơm mẫu tự động. Chất phân tích được tách trên cột sắc ký J&W DB5 MS (chiều dài 30 m, đường kính trong 0.25 mm và bề dày lớp pha tĩnh 0.25 µm). Khí Heli được sử dụng làm khí mang với tốc độ 1,15 mL/phút ở chế độ tuyến tính (liner velocity flow control mode). Chương trình nhiệt độ cột được cài đặt ở 90oC giữ trong 2 phút trước khi tăng đến 300oC với tốc độ 8oC/phút, giữ ở nhiệt độ cuối cùng này trong 4 phút. Chương trình nhiệt độ MS với nhiệt độ bơm mẫu, nhiệt độ nguồn ion, và nhiệt độ detector là 250, 220 và 300oC. Áp suất đầu cột là 72 kPa.
3.1.1.2. Xây dựng đường chuẩn cho fenobucarb
Sử dụng điều kiện vừa được xác định ở trên để xây dựng đường chuẩn cho phép định lượng fenobucarb bằng phương pháp ngoại suy. Các dung dịch chuẩn fenobucarb với nồng độ là 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 µg/L trong dung mơi hexane được đo trên thiết bị GC/MS với các điều kiện đo đã chọn.
Kết quả phân tích các mẫu chuẩn được chỉ ra ở bảng 3.3. Từ nồng độ mẫu chuẩn và diện tích pic, dựng đồ thị tương quan giữa hai đại lượng này, phương trình tương quan có dạng y = ax + b.
Bảng 3.3. Nồng độ và diện tích pic của các chất trong dung dịch chuẩn
Nồng độ (µg/L)
Diện tích pic (6,28 phút) 0 0 0,2 1572000 0,4 3118162 0,6 4664323 0,8 6210485
Từ kết quả ở bảng 3.3 dựng đường chuẩn và phương trình tương quan giữa diện tích tích pic và nờng độ chuẩn. Kết quả đồ thị các đường chuẩn và sắc ký đồ được chỉ ra ở hình 3.3.
fenobucarb: y = 7730,6x + 25838 (3.1) R2 = 0,9982
Hình 3.3. Sắc ký đồ của fenobucarb ở nồng độ chuẩn
Hình 3.4. Đường chuẩn của fenobucarb
Đường chuẩn này được sử dụng để tính tốn nờng độ các chất trong các nghiên cứu tiếp theo của luận văn.
Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) Để xác định LOD, một dung dịch fenobucarb với nờng độ là 0,5 µg/L được dùng để phân tích. Sau tiến hành pha lỗng và đo mẫu đến các nờng độ 0,1; 0,05; 0,02; 0,01 µg/L...Ở nồng độ 0,02 µg/L cho kết quả chiều cao của pic chất phân tích gấp 3 lần tín hiệu đường nền, ở nờng độ 0,01 µg/L khơng nhìn thấy pic của fenobucarb, do đó nờng độ 0,02 µg/L là nồng độ thấp nhất mà chiều cao tín hiệu pic của các chất phân tích gấp 3 lần tín hiệu đường nền. Từ các kết quả thu được xử lý thống kê để xác định LOD, LOQ theo mục 2.3.3, kết quả chỉ ra ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. LOD và LOQ của fenobucarb
Các thông số Fenobucarb
Cmin Cmin1 0,021 Cmin2 0,021 Cmin3 0,020 S/N S/N1 13,41 S/N2 13,53 S/N3 13,41 Cmintb 0,021 S/Ntb 13,45 SD 0,0006 RSD (%) 2,8 LOD µg/L) 0,005 LOQ (µg/L) 0,015
Kết quả thu được giới hạn phát hiện của fenobucarb là 0,005 µg/L. Giới hạn định lượng của fenobucarb là 0,015 µg/L.
Độ chính xác của phép đo
Để đánh giá sai số và độ lặp lại của phép đo, tiến hành dựng đường ch̉n, pha 3 mẫu có nờng độ ở điểm đầu, điểm giữa và điểm cuối của khoảng tuyến tính là (0,3; 0,6 và 0,9 µg/L), thực hiện đo mỗi mẫu 4 lần. Các kết quả được chỉ ra ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Sai số và độ lặp lại của phép đo tại các nồng độ khác nhau
Nhận xét: Phần trăm sai số và hệ số biến thiên CV của phép đo tại 3 mức nờng độ 0,3; 0,6; 0,9 µg/L có giá trị từ 1,6 - 8,2% đều nằm trong giới hạn cho phép của EPA [48]. Do đó các thông số phương pháp đo này được sử dụng để phân tích mẫu trong các nghiên cứu tiếp theo của luận văn.
3.1.2. Quy trình chiết tách fenobucarb trong nước
Hai phương pháp chiết lỏng - lỏng và chiết pha rắn được khảo sát để xác định hiệu suất thu hồi của fenobucarb trong mẫu nước. Trên cơ sở đó lựa chọn phương pháp chiết phù hợp với nội dung nghiên cứu của luận văn.
Khảo sát hiệu suất thu hồi của phương pháp chiết lỏng - lỏng
Thí nghiệm được tiến hành theo quy trình mục 2.2.2. Lấy 2 mL dung dịch chuẩn 500 µg/L fenobucarb hòa tan trong 5 mL acetone và thêm vào trong 1000 mL nước cất. Thực hiện quy trình chiết mẫu và định lượng trên thiết bị GC/MS để đánh giá hiệu suất. Tiến hành 2 mẫu song song. Kết quả xác định hiệu suất thu hồi của fenobucarb trong mẫu nước thêm chuẩn được đưa ra ở bảng 3.6.
Khảo sát hiệu suất thu hồi của phương pháp chiết SPE
Tiến hành thí nghiệm theo quy trình ở mục 2.2.3. Lấy 2 mL dung dịch chuẩn 500 µg/L của fenobucarb hòa tan trong 5 mL acetone và thêm vào trong 1000 mL nước cất. Thực hiện quy trình chiết mẫu và định lượng trên thiết bị GC/MS để đánh giá hiệu suất. Tiến hành 2 mẫu song song. Kết quả xác định
Dung dịch chuẩn Nồng độ Nồng độ ban đầu Xtb (%) CV (%)
Đo lần 1 Đo lần 2 Đo lần 3 Đo lần 4
0,30 (µg/L) 0,30 0,28 0,29 0,29 0,30 0,29 4,90 0,60 (µg/L) 0,60 0,59 0,59 0,58 0,60 0,59 2,40 0,90 (µg/L) 0,90 0,88 0,89 0,88 0,90 0,89 2,00
hiệu suất thu hồi của fenobucarb trong mẫu nước thêm chuẩn được đưa ra ở bảng 3.6.
Bảng 3.6. Hiệu suất thu hồi fenobucarb của phương pháp chiết lỏng-lỏng và
chiết SPE Phương pháp Nồng độ ban đầu (µg/L) Nồng độ đo được (µg/L) Hiệu suất trung bình (%) Mẫu 1 Mẫu 2 Lỏng- lỏng 1,00 0,95 0,94 94,50 SPE 1,00 0,91 0,92 91,50
Từ kết quả hiệu suất thu hồi của các chất theo 2 phương pháp chiết ở trên, chúng tôi chọn phương pháp chiết lỏng - lỏng cho nghiên cứu của luận văn, bởi hiệu suất chiết cao hơn, trang thiết bị đơn giản phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm.
Tiến hành đánh giá độ lặp lại và độ đúng của phương pháp chiết lỏng – lỏng so với các giới hạn trong các tài liệu EPA [48]. Tiến hành lặp lại 6 thí nghiệm trên cùng 1 mẫu nước thêm chuẩn theo quy trình chiết lỏng - lỏng ở mục 2.2.2. Kết quả hiệu suất chiết 6 mẫu nước thêm chuẩn được thống kê ở bảng 3.7. Xử lý thống kê số liệu ở các bảng 3.7 theo phương pháp xử lý số liệu ở mục 2.3.3 các kết quả được chỉ ra ở bảng 3.8.
Bảng 3.7. Hiệu suất thu hồi của fenobucarb của phương pháp chiết lỏng-lỏng
TT Thuốc trừ sâu
Nồng độ ban đầu (µg/L)
Nồng độ xác định được (µg/L) Hiệu suất (%) MC1 MC2 MC3 MC4 MC5 MC6 1 fenobucarb 0,60 0,58 0,58 0,57 0,59 0,60 0,57 96,9
Bảng 3.8. Nờng độ trung bình, hiệu suất chiết và độ lệch chuẩn, độ chính xác
của phương pháp chiết lỏng - lỏng
TT Thuốc trừ sâu Nồng độ trung bình (µg/L) Hiệu suất trung bình (%) RSD (%) Độ chính xác (quy tắc 2δ) 1 fenobucarb 0,58 96,9 2,01 96,9 ± 4,02
Nhận xét: Hiệu suất chiết trung bình của fenobucarb trên 90% và độ
lệch chuẩn tương đối là 2,01% .
Bảng 3.9. So sánh các phương pháp chiết đã khảo sát
Thông số chung Chiết lỏng - lỏng Chiết SPE
Thời gian chiết trung bình
(giờ) 0,75 1
Cột chiết C18
Không Có
Cất quay chân không
Có Có
Rửa giải
Không Có
Đông khô -80oC
Không Có
Hiệu suất chiết
Cao Cao
Chi phí
Trung bình Cao Dung mơi sử dụng (mL)
DCM: 90 mL hexane: 20 mL
DCM: 20 mL hexane: 20 mL
So sánh quy trình chiết fenobucarb trong mẫu nước bằng 2 phương pháp chiết lỏng - lỏng và chiết SPE:
Từ kết quả thu được ở bảng 3.6, bảng 3.8 và bảng 3.9 rút ra các nhận xét sau:
- Hiệu suất chiết của 2 phương pháp chiết đều cao, nhưng phương pháp chiết lỏng-lỏng cao hơn so với chiết SPE.
- Phương pháp chiết lỏng-lỏng tốn nhiều dung môi, nhưng thời gian chiết, chi phí và trang thiết bị đơn giản hơn so với chiết SPE.
- Độ chính xác của phương pháp chiết lỏng-lỏng cho fenobucarb với mẫu thêm chuẩn là 96,9% nằm trong khoảng tiêu chuẩn EPA 617 là 91 - 101% [48] nên có thể áp dụng phương pháp chiết trên để xác định mẫu thực tế.
Với các kết quả trên, chúng tơi chọn phương pháp chiết lỏng-lỏng cho quy trình định lượng fenobucarb trong mẫu nước bằng thiết bị GC/MS với cách tiến hành như sau:
Mẫu nước được đưa về nhiệt độ phòng trước khi phân tích. Lấy 1L mẫu nước cho vào phễu chiết dung tích 2L, thêm 30 g muối NaCl. pH của mẫu được điều chỉnh tới pH = 7 bằng 1 mL dung dịch đệm photphat. Tiến hành chiết mẫu 3 lần bằng dung mơi dichloromethane với thể tích lần lượt là 50, 30, 10 mL. Sau khi chiết, dịch chiết được loại nước bằng 10 g Na2S04 khan, sau đó dịch chiết được cô đặc về 2 - 3 mL bằng máy cất quay chân không. Chuyển dung môi bằng cách thêm 10 mL hexane vào dịch chiết, rời cơ cịn 5 mL. Dịch chiết cuối cùng được làm giàu chính xác về l mL bởi sử dụng dịng khí N2, đo mẫu trên thiết bị GC/MS.
Định lượng fenobucarb trên GC/MS được xác định như sau: 1 µL mẫu được bơm ở chế độ không chia dòng. Chất phân tích được tách trên cột sắc ký ZB5MSi (dài 30m, đường kính trong 0,25mm, lớp hấp phụ pha tĩnh dày 0,25μm) (Phenomenex). Khí Heli được sử dụng làm khí mang với tốc độ 1,15 mL/phút ở chế độ tuyến tính. Chương trình nhiệt độ cột được cài đặt ở 90oC giữ trong 2 phút trước khi tăng đến 300oC với tốc độ 8oC/phút, giữ ở nhiệt độ
cuối cùng này trong 4 phút. Chương trình nhiệt độ MS với nhiệt độ bơm mẫu, nhiệt độ nguồn ion, và nhiệt độ detector tương ứng là 250, 230 và 300oC. Áp suất đầu cột là 72 kPa
Hình 3.5. Sơ đồ quy trình chiết lỏng - lỏng mẫu nước
Thởi khi nitơ đến:1 mL
Chuyển sang vial
GC/MS
+{Thêm chuẩn}
+ DCM: 50, 30, 10 mL + NaCl: 30g
Phễu chiết: 1000 mL mẫu
Lắc: 15 phút
Loại nước: dùng 10g Na2SO4 khan Chiết mẫu
Cất quay chân không: đến 5 mL
Thêm hexane: 10 mL, 10mL
3.2. NGHIÊN CỨU SỰ PHÂN HỦY CỦA FENOFUCARD TRONG HỆ ĐẤT- NƯỚC DƯỚI SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG
3.2.1. Thành phần cơ giới và tích chất vật lý và hóa học của mẫu đất nghiên cứu
Bảng 3.10 Một số tính chất vật lý và hóa học của cột đất nghiên cứu
Kết quả phân tích khơng tìm thấy sự có mặt của fenobucarb trong mẫu đất nghiên cứu. Thành phần cơ giới và tích chất vật lý và hóa học của mẫu đất được trình bày trong bảng 3.10. Mẫu đất nghiên cứu có cấu trúc cát pha mùn, và khơng có mặt fenobucarb trong mẫu đất nghiên cứu này
3.2.2. Phân hủy fenobucarb trong hệ đất – nước dưới ảnh hưởng của pH
Nồng độ của fenobucarb và nồng độ của chất chuyển hóa (2-giây- butylphenol) trong pha đất, pha nước và tổng lượng tồn dư trong hệ đất-nước với pH 7 được biểu thị và thể hiện trong Hình 1 dưới dạng hàm số của thời gian. Lượng cịn lại là tởng lượng fenobucarb hoặc 2 giây-butylphenol trong cả