Cũng như các quy trình định lượng khác, phương pháp chiết tách đóng vai trò rất quan trọng trong quy trình định lượng hỗn hợp fenobucarb trong mẫu nước. Có nhiều phương pháp chiết tách riêng rẽ từng chất fenobucarb bằng các phương pháp chiết lỏng-lỏng hay chiết SPE đã được chỉ ra ở bảng 1.6. Để phục vụ cho phần nghiên cứu tiếp theo của luận án chúng tôi phải tiến hành khảo sát, xác định các điều kiện chiết tách để có được quy trình chiết tách fenobucarb sao cho phương pháp khả thi về kinh tế nhưng vẫn đảm bảo hiệu suất và độ lặp lại cao, phù hợp với trang thiết bị phòng thí nghiệm. Trên cơ sở đó, hai phương pháp chiết lỏng - lỏng và chiết pha rắn được khảo sát để lựa chọn phương pháp phù hợp với đối tượng nghiên cứu.
Phương pháp chiết lỏng-lỏng
Quy trình chiết lỏng-lỏng trong mục 2.2.2 dùng để chiết tách gần 950 chất ô nhiễm hữu cơ có độ phân cực khác nhau từ kém phân cực đến rất phân cực trong mẫu nước, trong đó có fenobucarb. Do đó chúng tôi tiến hành tách chiết hỗn hợp fenobucarb ra khỏi nền mẫu bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng, dự kiến quy trình được tiến hành như trong mục 2.2.2.
Phương pháp chiết pha rắn
Để chiết tách fenobucarb trong mẫu nước bằng phương pháp SPE chúng tôi sử dụng phương pháp mà Gonzalez và các cộng sự [69] đã xây dựng theo quy trình như sau:
Lấy 1000 mL mẫu nước được điều chỉnh tới pH = 7 bằng 1 mL dung dịch đệm photphate, sau đó chiết trên cột C18 (sau khi hoạt hóa lần lượt với 3 mL dichloromethane:3 mL methanol:3 mL H2O) với tốc độ dòng 8 mL/phút trên hệ chiết mẫu lỏng tự động. Sau đó cột C18 được thổi khô 30 phút, và rửa giải bằng 2 mL dichloromethane (3 lần), tiếp đến rửa giải với 2 mL hỗn hợp dichloromethane:hexane (tỷ lệ 1:1) (3 lần), cuối cùng rửa
giải với 2 mL hexane (3 lần). Dung dịch rửa giải được đông khô ở -800C, sau đó pha hữu cơ còn lại đươc cất quay chân không, phần cặn được hòa tan trong 1 mL hexane và phân tích trên thiết bị GC/MS.
2.2.2. Chuẩn bị mẫu đất dùng cho thí nghiệm
Mẫu đất được lấy ở lớp đất mặt trên diện tích 5 m2 từ ruộng lúa ở khu vực nghiên cứu. Mẫu đất được sấy khô, nghiền mịn qua rây 2 mm. Sau đó trộn thuốc trừ sâu vào trong đất: Lấy 50 g đất trộn với 20 mL acetone để tạo thành dung dịch đất, sau đó bơm vào 10 mL dung dịch chuẩn fenobcarb (100 mg/L), để bay hơi acetone sau 48 giờ trong tủ hút. Tiếp theo mẫu đất đã bơm thuốc trừ sâu này được nghiền mịn và trộn đều với khoảng 150 g đất và định lượng đến 200 g để đạt được nồng độ ban đầu của thuốc trừ sâu fenobucarb trong mẫu đất này là 5 µg/g khối lượng khô. Bảo quản ở -4oC cho đến khi thí nghiệm.
Mẫu đất ban đầu được phân tích để xác định thành phần cơ giới, tính chất vật lý và hóa học. Mẫu đất cững được phân tích để xác định xem có sự tồn tại của fenobucarb trong mẫu đất nghiên cứu hay không. Kết quả các phân tích này được trình bày trong phần Kết quả và thảo luận. 2.2.3. Thí nghiệm nhả hấp phụ fenobucarb dưới một số điều kiện môi trường
2.2.3.1.Thí nghiệm phân hủy fenobucarb từ đất dưới mức pH khác nhau trong nước
Cân 2 g đất cho vào lọ thủy tinh, thêm vào 20 mL dung dịch nước có các pH =5; 7; 9. Để vào máy lắc và lắc mẫu ở nhiệt độ phòng với tốc độ 150 rpm. Sau mỗi khoảng thời gian thí nghiệm, mẫu sẽ được lấy ra và ly tâm tách riêng 2 phần đất và nước để chiết tách và xác định fenobucarb trong đất và nước.
2.2.3.2.Thí nghiệm phân hủy fenobucarb từ đất dưới SDS trong nước
Cân 2 g đất cho vào lọ thủy tinh, thêm vào 20 mL dung dịch SDS 1 cmc, đậy nắp. Để vào máy lắc và lắc mẫu ở nhiệt độ phòng với tốc độ 150 rpm. Sau mỗi khoảng thời gian thí nghiệm, mẫu sẽ được lấy ra và tách riêng 2 phần đất và nước để chiết tách và xác định fenobucarb trong đất và nước.
Bảng 2.3. Bảng thời gian lấy mẫu trong các thí nghiệm TT Thời gian Thí nghiệm 2.2.3.1 Thí nghiệm 2.2.3.1 Thí nghiệm 2.2.3.2 Thí nghiệm 2.2.3.3 pH = 5 pH = 7 pH = 9 SDS
1 2 giờ Lấy mẫu, chiết tách, phân tích
Lấy mẫu, chiết tách, phân tích
Lấy mẫu, chiết tách, phân tích
Lấy mẫu, chiết tách, phân tích 2 1 ngày -#- -#- -#- -#- 3 2 ngày -#- -#- -#- -#- 4 3 ngày -#- -#- -#- -#- 5 4 ngày -#- -#- -#- -#- 6 5 ngày -#- -#- -#- -#-
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp định lượng mẫu trên GC/MS
Các phép đo được thực hiện trên thiết bị GC/MS, Thermo Trace GC 1310 tại phòng Hóa sinh môi trường, Viện Hóa học. Cột HP5-MS (Agilent, Joa Kỳ) với các thông số như sau: chiều dài 30m, đường kính trong 0,25mm, lớp hấp phụ pha tĩnh dày 0,25μm được sử dụng cho phân tách các hợp chất. Detector MS đơn tứ cực với nguồn ion hóa va chạm electron (electron impact –EI). Sơ đồ thiết bị được mô tả ở Hình 2.1.
Khí mang: Heli với độ tinh khiết 99.999%, dung môi: Hexane. Thư viện phổ NIST 2017 được sử dụng để so sánh các thông tin thu được. Chương trình nhiệt, các thông số hoạt động của GC và MS được thiết lập với các điều kiện như sau:
Chương trình nhiệt độ lò cột: Nhiệt độ 400C/2 phút. Tăng 310°C với tốc độ 8°C/phút, giữ 3100C/4 phút
Tổng thời gian phân tích: 39,75 phút Nhiệt độ cổng bơm: 250 °C
Thể tích mẫu bơm vào: 1 μL, không chia dòng (splitless) Tốc độ khí mang: 1,2 mL/phút
Nhiệt độ ion source: 200 0C Nhiệt độ Interface: 300 0C Thời gian cắt dung môi 6 phút
Khoảng quét 33 - 600 amu
Tốc độ quét 0,35 s/scan
2.3.3. Phương pháp xử lý số liệu
Nghiên cứu sử dụng phương trình hồi quy và phân tích tương quan để xác định mối liên quan giữa các đại lượng nghiên cứu thông qua hệ số tương quan R2 bằng các sử dụng phần mềm trợ giúp Microsolf Excel 2007, Modde 8.2.
Phương pháp xử lý số liệu thống kê được dùng để đánh giá độ lặp, độ tin cậy của phép đo. Một số đại lượng thống kê sử dụng trong xử lý số liệu:
- Giá trị trung bình X : n i i X n X 1 1 (2.1)
- Độ lệch chuẩnS của phép đo (SD):
1 ) ( 1 2 n X X S n i i (2.2)
X S
Sr .100% (2.3)
- Giới hạn phát hiện (LOD) [72]:
N S
C
LOD 3. m in (2.4)
Cmin: Nồng độ nhỏ nhất mà chiều cao tín hiệu pic của chất phân tích gấp 3 lần tín hiệu đường nền. S/N: Tín hiệu nền
- Giới hạn định lượng (LOQ) [72]: LOQ3,33.LOD (2.5)
- Độ chính xác của phép đo: Theo ISO, độ chính xác của phép đo được đánh giá qua độ đúng và độ chụm. Độ chụm là mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ của các phép đo lặp lại. Độ đúng là mức độ gần nhau của giá trị phân tích với giá trị thực. Độ đúng được biểu diễn dưới dạng sai số tuyệt đối hoặc sai số tương đối. Sai số được tính theo công thức:
% 100 % t t i S S S X (2.6) n X X n i i tb 1 % % (2.7)
Trong đó: %X: Sai số phần trăm tương đối. Si : giá trị đo được tại mỗi lần đo i.
St : giá trị tìm được theo lý thuyết (đường chuẩn). n: số lần đo.
+ Độ lặp lại của phép đo: Được xác định theo các đại lượng S2, CV.
2 S 1 ) ( 2 n S Si tb (2.8) 100 tb S S CV (2.9)
Trong đó: Stb: Nồng độ trung bình, n: số lần đo, S: độ lệch chuẩn
CV: hệ số biến động của phép đo. + Khoảng tin cậy: Z hay xZ
Với cơ số mẫu bé, σ chính là S hoặc SRD.
Trong nghiên cứu này với xác suất tin cậy là 96%, tương ứng với Z = 2 (quy tắc 2σ) được sử dụng để đánh giá độ tin cậy của phép đo [73].
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT VÀ TÁCH FENOBUCARD TRONG NƯỚC
3.1.1. Phương pháp định lượng fenobucarb trên GC/MS
3.1.1.1. Khảo sát các điều kiện đo
Hợp chất fenobucarb thuộc nhóm HCBVTV carbamate để có phương pháp xác định hợp chất này dùng cho các nghiên cứu trong luận văn và để phù hợp với trang thiết bị của phòng thí nghiệm. Chúng tôi sẽ nghiên cứu xác định các điều kiện tối ưu để định lượng hợp chất này trên thiết bị GC/MS.
Khảo sát các điều kiện đo trên thiết bị GC/MS (Trace 2000, Thermo) với hệ lấy mẫu tự động để xác định hợp chất fenobucarb được căn cứ trên các nghiên cứu trước đây [74].
- Với các điều kiện cố định: 1 µL mẫu được bơm (ở chế độ không chia dòng), chất phân tích được tách trên cột sắc ký ZB5MSi (dài 30m, đường kính trong 0,25mm, lớp hấp phụ pha tĩnh dày 0,25μm) (Phenomenex). Khí Heli được sử dụng làm khí mang với chế độ tuyến tính (liner velocity flow control mode).
- Các điều kiện được nghiên cứu khảo sát: Nhiệt độ lò cột, nhiệt độ bơm mẫu, nhiệt độ detector, tốc độ khí mang.
- Các mẫu dùng để khảo sát: Dung dịch chuẩn hợp chất của thuốc trừ sâu fenobucarb với nồng độ mỗi chất là 1 ppm, và mẫu chiết từ nước cất vào chuẩn hợp chất fenobucarb. Kết quả đã khảo sát chế độ đo với các điều kiện được đưa ra ở bảng 3.1, thời gian lưu và giá trị mảnh phổ của các chất được chỉ ra ở bảng 3.2
+ Lần khảo sát thứ 1: Khi đo dung dịch chuẩn fenobucarb, thời gian lưu của fenobucarb là 5,21 phút. Khi tiến hành đo mẫu chiết từ nước sông thì các pic tách nhau không rõ và chân pic không đối xứng. Như vậy điều kiện nhiệt độ cột đẳng nhiệt không tách được hợp chất fenobucarb.
+ Lần khảo sát thứ 2: Hạ nhiệt độ cột GC xuống 40oC (thấp hơn nhiệt độ sôi của fenobucarb) giữ trong 1 phút, sau đó tăng nhiệt độ lên 280°C với tốc độ 8°C/phút, và giữ ở nhiệt độ cuối cùng 5 phút. vẫn giữ nhiệt độ bơm mẫu, nhiệt độ nguồn ion, và nhiệt độ detector tương ứng là 250oC, 200°C, và 300oC. Kết quả, thời gian lưu của fenobucarb là 5,52 phút và trên sắc đồ của mẫu có xuất hiện các pic phụ trước đó. Tuy nhiên, khi đo mẫu chiết từ mẫu nước sông, sắc ký đồ có nhiều pic phụ cạnh pic fenobucarb với chân pic rộng. Phương pháp này dùng để định lượng fenobucarb trong mẫu nước ở các nghiên cứu sau nên điều kiện này cũng không được lựa chọn.
+ Lần khảo sát thứ 3: Giữ nguyên chương trình nhiệt độ GC như lần 2, nhưng thay đổi chương trình nhiệt độ MS, tăng nhiệt độ nguồn ion lên 220oC. Kết quả thu được cho thấy ở chế độ này các chất có trong mẫu được tách tốt hơn nhưng vẫn còn nhiễu nền, đồng thời pic sắc ký của fenobucarb cân, đều và thời gian lưu là 6,28 phút.
+ Lần khảo sát thứ 4: Giữ nguyên chương trình nhiệt độ GC, MS như lần 3, nhưng giảm tốc độ khí mang xuống 1,15 mL/phút. Kết quả thu được cho thấy ở chế độ này các chất có trong mẫu được tách tốt hơn, đồng thời các pic sắc ký của fenobucarb cân, đều và thời gian lưu là 6,28 phút.
+ Lần khảo sát thứ 5: Giữ nguyên chương trình nhiệt độ MS, tốc độ khí mang như lần 4, tăng nhiệt độ ban đầu GC lên 90oC. Kết quả thu được cho thấy ở chế độ này chất có trong mẫu vẫn được tách tốt, pic sắc ký cân và đều. Thời gian phân tích rút ngắn là 7 phút. Thời gian lưu của fenobucarb là 6,28 phút (hình 3.1), phổ khối của các chất được chỉ ra ở hình 3.2.
Bảng 3.1. Điều kiện khảo sát để định lượng fenobucarb trên thiết bị GC/MS
TT GC MS Tốc độ
dòng khí mang Chương trình nhiệt độ cột Nhiệt độ
bơm mẫu Nhiệt độ nguồn ion Nhiệt độ detector AIQS- DB 400C/2 phút, tăng đến 310°C với tốc độ 8°C/phút giữ ở nhiệt độ cuối cùng 4
phút 250oC 200oC 300oC 1,2 mL/phút Lần 1 1400C 250oC 200oC 300oC 1,2 mL/phút Lần 2 400C/ 2 phút, tăng đến 2800C, tốc độ 80C/phút, giữ
ở nhiệt độ cuối cùng 5 phút 250oC 200oC 300oC
1,2 mL/phút
Lần 3
400C/2 phút, tăng đến 2800C, tốc độ 80C/phút, giữ
ở nhiệt độ cuối cùng 5 phút 250oC 220oC 300oC
1,15 mL/phút mL/phút
Lần 4
900C/2 phút, tăng đến 3000C, tốc độ 80C/phút, giữ
ở nhiệt độ cuối 4 phút 250oC 220oC 300oC
1,15 mL/phút
Lần 5
900C/2 phút, tăng đến 3000C, tốc độ 80C/phút, giữ
ở nhiệt độ cuối 4 phút 250oC 220oC 300oC
1,15 mL/phút
Hình 3.1. Sắc ký đồ của chuẩn fenobucarb
Bảng 3.2. Mảnh phổ chuẩn và thời gian lưu của chất phân tích
Mảnh phổ (m/z) Thời gian lưu (phút)
chính phụ Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Fenobucarb 150 121 5,21 5,52 6,28 6,28 6,28
Hình 3.2. Phổ khối của fenobucarb
Kết quả nghiên cứu đã tiến hành khảo sát được các điều kiện để định lượng hợp chất fenobucarb trên thiết bị GC/MS được xác định như sau:
Mẫu được bơm với thể tích 1 µL ở chế độ không chia dòng (splitless) với hệ lấy mẫu tự động và bộ bơm mẫu tự động. Chất phân tích được tách trên cột sắc ký J&W DB5 MS (chiều dài 30 m, đường kính trong 0.25 mm và bề dày lớp pha tĩnh 0.25 µm). Khí Heli được sử dụng làm khí mang với tốc độ 1,15 mL/phút ở chế độ tuyến tính (liner velocity flow control mode). Chương trình nhiệt độ cột được cài đặt ở 90oC giữ trong 2 phút trước khi tăng đến 300oC với tốc độ 8oC/phút, giữ ở nhiệt độ cuối cùng này trong 4 phút. Chương trình nhiệt độ MS với nhiệt độ bơm mẫu, nhiệt độ nguồn ion, và nhiệt độ detector là 250, 220 và 300oC. Áp suất đầu cột là 72 kPa.
3.1.1.2. Xây dựng đường chuẩn cho fenobucarb
Sử dụng điều kiện vừa được xác định ở trên để xây dựng đường chuẩn cho phép định lượng fenobucarb bằng phương pháp ngoại suy. Các dung dịch chuẩn fenobucarb với nồng độ là 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 µg/L trong dung môi hexane được đo trên thiết bị GC/MS với các điều kiện đo đã chọn.
Kết quả phân tích các mẫu chuẩn được chỉ ra ở bảng 3.3. Từ nồng độ mẫu chuẩn và diện tích pic, dựng đồ thị tương quan giữa hai đại lượng này, phương trình tương quan có dạng y = ax + b.
Bảng 3.3. Nồng độ và diện tích pic của các chất trong dung dịch chuẩn
Nồng độ (µg/L)
Diện tích pic (6,28 phút) 0 0 0,2 1572000 0,4 3118162 0,6 4664323 0,8 6210485
Từ kết quả ở bảng 3.3 dựng đường chuẩn và phương trình tương quan giữa diện tích tích pic và nồng độ chuẩn. Kết quả đồ thị các đường chuẩn và sắc ký đồ được chỉ ra ở hình 3.3.
fenobucarb: y = 7730,6x + 25838 (3.1) R2 = 0,9982
Hình 3.3. Sắc ký đồ của fenobucarb ở nồng độ chuẩn
Hình 3.4. Đường chuẩn của fenobucarb
Đường chuẩn này được sử dụng để tính toán nồng độ các chất trong các nghiên cứu tiếp theo của luận văn.
Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) Để xác định LOD, một dung dịch fenobucarb với nồng độ là 0,5 µg/L được dùng để phân tích. Sau tiến hành pha loãng và đo mẫu đến các nồng độ 0,1; 0,05; 0,02; 0,01 µg/L...Ở nồng độ 0,02 µg/L cho kết quả chiều cao của pic chất phân tích gấp 3 lần tín hiệu đường nền, ở nồng độ 0,01 µg/L không nhìn thấy pic của fenobucarb, do đó nồng độ 0,02 µg/L là nồng độ thấp nhất mà chiều cao tín hiệu pic của các chất phân tích gấp 3 lần tín hiệu đường nền. Từ các kết quả thu được xử lý thống kê để xác định LOD, LOQ theo mục 2.3.3, kết quả chỉ ra ở bảng 3.4.